謝紅 金航 陳蘭 陳智超 葛平玉 楊閩能

（1 貴州中醫(yī)藥大學2021 級碩士研究生 貴陽 550025；2 貴州中醫(yī)藥大學2022 級碩士研究生 貴陽 550025；3 貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 貴陽 550001；4 貴州省德江縣民族中醫(yī)院 德江 565200）

據統(tǒng)計，全球超過1.5 億男性受到勃起功能障礙（Erectile Dysfunction, ED）的困擾，其中年齡在40～70 歲者約占50%[1]，給男性及其伴侶的生活質量造成了嚴重不良影響。目前已有研究明確ED 是心血管疾病的早期預警因子，兩者不僅有相同的危險因素，如代謝綜合征（Metabolic Syndrome, MS）、高尿酸血癥、糖尿病、肥胖和缺乏運動等，也有一致的病理生理學基礎。已有學者通過研究證實，在該病的諸多病理基礎中，內皮功能障礙的作用不容忽視[2]。中醫(yī)將ED 歸為“陽痿”范疇，中醫(yī)辨證論治ED 療效確切，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥復方祛瘀化痰二仙湯可有效保護高尿酸血癥患者的血管內皮功能和勃起功能，但其作用機制尚不清楚，而尿酸誘導的損傷與無菌炎癥有關。因此，本研究通過觀察祛瘀化痰二仙湯對老齡高尿酸血癥大鼠陰莖海綿體勻漿組織NLRP3 炎癥小體和下游炎癥因子以及陰莖海綿體血管內皮功能的影響，以探討其改善勃起功能的機制?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物 本研究按照貴州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的相關審查結果和規(guī)定進行。篩選納入75 只18 月齡雄性SD 大鼠，無特定病原體（Specific Pathogen Free,SPF）級，平均體質量（550±20）g。由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF 室提供（動物生產許可證號：SCXK〈黔〉2019-0001）。

1.2 藥品和試劑 參照課題組前期研究成果[3]將《婦產科學》中的經典方劑二仙湯加減化裁，得到祛瘀化痰二仙湯，藥物組成：仙靈脾10 g，仙茅l0 g，薏苡仁20 g，浙貝母20 g，車前子10 g，地龍10 g。按照該藥方的配伍和劑量，制成含不同濃度生藥的合劑，三份合劑中，生藥的濃度分別為0.324 g/ml、0.648 g/ml、1.296 g/ml。每份合劑均一次性煎制3 d 的劑量，并于4℃的環(huán)境中冷藏。其他試劑還包括酵母干粉（批號：201101-2）；阿撲嗎啡（美國 Sigma-Aldrich公司）；氧嗪酸鉀鹽（批號：210112-3）；鹽酸乙胺丁醇片（國藥準字H42022126）。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-Like Receptor Protein 3, NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（Apoptosis-Associated Speck-Like Protein,ASC）、半胱氨酸蛋白酶 -1（Caspase-1）一抗和β-Actin 多克隆抗體（Abcam 公司）；內皮素-1（Endothelin-1, ET-1）、白介素 -1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白介素 -18（Interleukin-18, IL-18）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒和一氧化氮（Nitric Oxide,NO）試劑盒。

1.3 儀器 16 通道的生理記錄儀（美國Biopac公司），MP150 型刺激電極（美國 Biopac 公司），AU680全自動生化分析儀（美國 Beckman Coulter），LG-21M 型離心機（四川蜀科儀器有限公司），電子分析天平（南通瑞科實驗儀器有限公司），ASQM-4型手術解剖顯微鏡（中科院光電技術研究所），Mini Protean3 Cell 電泳儀（伯樂生命醫(yī)學產品〈上海〉有限公司）。

2 研究方法

2.1 分組和模型制備 所有實驗動物接受常規(guī)飼養(yǎng)方式：自由飲水，并給予普通飼料進行喂養(yǎng)，實驗開始前適應性喂養(yǎng)1 周。將所有大鼠按照電腦生成的隨機數(shù)字表法進行自由編號，并分為正常組（N組）、模型組（M 組）、祛瘀化痰二仙湯高、中、低劑量組（Qh 組、Qm 組、Ql 組），每組 15 只。模型制備參照本課題組前期已報道方法進行[4]。以陰莖海綿體內壓 / 平均動脈壓（Intracavernous Pressure/Mean Arterial Pressure,ICP/MAP）判定大鼠勃起功能。11周時模型組和祛瘀化痰二仙湯中劑量組各有1 只大鼠因灌胃及皮下注射不當導致腹腔感染死亡，最終共73 只雄性SD 大鼠造模成功。

2.2 給藥 造模成功后的第2 天開始，所有實驗動物每日均采用灌胃的方式在同一時間點進行給藥，N 組和M 組均給予蒸餾水，兩組劑量均為10ml/（kg·d）；Qh、Qm、Ql 組按照大鼠體質量進行折算，并給予相應等效劑量的藥液灌胃，三組劑量依次為：1.296 g/（kg·d）、0.648 g/（kg·d）、0.324 g/（kg·d），每天給予藥液灌胃1 次，共12 周。

2.3 標本 完成12 周的實驗后，于次日處死大鼠（頸椎脫位法），立即解剖游離出陰莖海綿體組織。組織處理的具體方法為：采用0.9%氯化鈉注射液反復沖洗組織，將其表面血漬清洗干凈，以濾紙反復吸干組織水分，儲存于-80℃冰箱中冷凍以備后用。檢測相關指標時，先將冷凍組織取出后以電子天平準確稱取需要重量的組織，并研碎，與0.9%氯化鈉注射液混合在冰水浴條件下進行勻漿，2 000 r/min 離心10 min，取上清液 3～4 ml 待測。

2.4 大鼠陰莖海綿體ICP/MAP 的檢測 參照文獻[4]所述方法，戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，沿頸部和腹部中線切開，直至露出頸動脈和海綿體神經，在醫(yī)學解剖顯微鏡下進行分離，注意避免周圍迷走神經損傷。然后，將肝素鹽水填充的導管插入動脈，并用于記錄平均壓力。雙極電極用于刺激神經，該電極與壓力傳感器和電生理記錄儀相連（參數(shù)：15 Hz、1.2 ms、7.5 V，共刺激1 min），記錄ICP 和MAP。治療結束后，處死大鼠，取出陰莖組織進行后續(xù)實驗。

2.5 ELISA 檢測大鼠陰莖海綿體組織中NO、ET-1、IL-1β、IL-18 含量 所有標準品的配制過程均嚴格參照說明書進行操作，加入標準品或待測樣品、充分混勻靜置、洗板（洗滌、印干），再加入第一抗體工作液充分混勻后靜置，重復前一步的洗板過程，再加入酶標抗體工作液后靜置，再次洗板，加入底物工作液后靜置，最終加入終止液，混勻后檢測吸光值。

2.6 Western Blot 法檢測大鼠陰莖海綿體組織中NLRP3 炎性體和下游炎癥因子表達 組織取出后加入裂解液進行細胞裂解，勻漿后離心，提取總蛋白，完成蛋白質濃度檢測，再通過轉膜緩沖液進行平衡，經膜處理、轉膜等程序后，再進行免疫印跡，內參抗體濃度為β-Actin（1:2 000），之后采用二抗孵育1 h[抗體濃度為免疫蛋白 G（IgG），1:5 000 配制]，洗膜，最終顯色所獲條帶使用ImageJ 1.51K 軟件分析。

2.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據采用SPSS23.0 軟件處理，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析Bonferroni 檢驗方法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠尿酸 （UA）、ICP/MAP 水平 與 N 組比較，M 組大鼠陰莖海綿體組織ICP/MAP 水平顯著下降（P＜0.05），UA 水平則顯著升高（P＜0.05）；與M 組比較，Qh 組大鼠陰莖海綿體組織ICP/MAP水平均顯著升高（P＜0.05），UA 水平則顯著降低（P＜0.05）。見表 1。

表1 實驗大鼠UA、陰莖海綿體組織ICP/MAP 比較（）

表1 實驗大鼠UA、陰莖海綿體組織ICP/MAP 比較（）

注：與 M 組比較，*P＜0.05。

組別 n UA（μmol/L） ICP/MAP Ql 組Qm 組Qh 組M 組N 組15 14 15 14 15 498.13±84.44 476.13±74.24 469.13±73.44 512.34±72.46 90.84±8.53 0.29±0.021*0.39±0.026*0.54±0.037*0.26±0.034 0.78±0.051

3.2 各組大鼠 NO、ET-1 水平 與 N 組比較，M 組大鼠陰莖海綿體組織NO 水平顯著降低（P＜0.05），ET-1 水平顯著升高（P＜0.05）；與 M 組比較，Qh 組海綿體組織 NO 水平顯著升高（P＜0.05），ET-1 水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 實驗大鼠陰莖海綿體組織血管內皮功能指標比較（）

表2 實驗大鼠陰莖海綿體組織血管內皮功能指標比較（）

注：與 M 組比較，*P＜0.05。

組別 n ET-1（pg/ml） NO（μmol/L）Ql 組Qm 組Qh 組M 組N 組15 14 15 14 15 141.32±3.82*133.44±4.62*119.84±5.58*158.31±2.90 108.23±5.27 24.18±3.18 28.66±3.37*32.57±2.25*21.46±4.45 38.76±3.58

3.3 各組大鼠IL-1β、IL-18 水平 與N 組比較，M組大鼠陰莖海綿體組織IL-1β、IL-18 水平顯著升高（P＜0.05）；與M 組比較，Qh 組大鼠陰莖海綿體組織 IL-1β、IL-18 水平均顯著降低（P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 實驗大鼠陰莖海綿體組織IL-1β、IL-18 表達比較（pg/ml，）

表3 實驗大鼠陰莖海綿體組織IL-1β、IL-18 表達比較（pg/ml，）

注：與 M 組比較，*P＜0.05。

組別 n IL-1β IL-18 Ql 組Qm 組Qh 組M 組N 組15 14 15 14 15 1 221.32±38.12*923.44±34.58*729.84±35.43*1 457.23±32.90 631.23±36.18 904.75±51.57*813.35±56.86 *714.12±50.23*1 116.45±64.57 539.76±58.61

圖1 各組大鼠陰莖海綿體組織 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18水平

3.4 各組NLRP3 炎性體蛋白水平 與N 組比較，M 組大鼠陰莖海綿體組織NLRP3 炎性體蛋白三項指標 NLRP3、ASC、Caspase-1 水平均顯著升高（P＜0.05）；與M 組比較，Qh 組大鼠陰莖海綿體組織NLRP3、ASC、Caspase-1 水平均顯著降低（P＜0.05）。見圖 1、表 4。

表4 實驗大鼠陰莖海綿體組織NLRP3 炎性體蛋白水平比較（）

表4 實驗大鼠陰莖海綿體組織NLRP3 炎性體蛋白水平比較（）

注：與 M 組比較，*P＜0.05。

組別 n NLRP3 ASC Caspase-1 Ql 組Qm 組Qh 組M 組N 組15 14 15 14 15 0.62±0.03*0.44±0.03*0.31±0.01*0.78±0.03 0.20±0.02 0.51±0.02*0.40±0.06*0.28±0.01*0.59±0.08 0.16±0.01 0.45±0.11*0.36±0.09*0.24±0.05*0.58±0.13 0.18±0.04

4 討論

陰莖勃起功能由多種刺激而引起，這些刺激可導致神經釋放NO，從而擴張血管，促進血液流向勃起組織，而ED 的發(fā)生可由多種病因所引起，ED 本質上為一種全身性血管疾病。UA 水平的異常升高可激活炎癥反應，從而損傷機體血管內皮功能，導致相關并發(fā)癥的發(fā)生[5～6]。高尿酸可直接抑制海綿體平滑肌舒張功能，破壞血管內皮源性舒張因子（EDRF）/NO 與血管內皮素（ET）的動態(tài)平衡，導致陰莖海綿體血管及平滑肌細胞（SMC）收縮功能失調，從而導致ED[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥ED 患者的血漿ET-1 水平較高而血漿NO 水平降低，其血管內皮功能存在異常[3]。同時，高尿酸血癥ED 患者陰莖海綿體動脈收縮期最大流速（PSV）、舒張末期血流速度（EDV）降低，陰莖血管阻力指數(shù)（RI）、陰莖血流指數(shù)（PFI）升高，陰莖海綿體的血流動力學改變與血管內皮功能損傷有關[8]，同時中藥可通過保護血管內皮功能進而改善高尿酸血癥患者的勃起功能[9]。

尿酸誘導的損傷與無菌炎癥有關，尿酸鹽結晶可通過激活補體經典代謝途徑等激活免疫系統(tǒng)，從而引發(fā)炎癥反應，同時還可增加活性氧的產生，而該物質已被多項研究證實可刺激NLRP3 炎性小體發(fā)揮生物學效應，而IL-1β 前體原本并無生物學活性，在已被激活的NLRP3 炎性小體的剪切后，IL-1β 則成為多種代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的重要因子，可引起血管內皮功能異常，與血管病變的發(fā)病機制相關[10]。本研究根據課題組前期研究成果，制備高尿酸ED大鼠模型[4]，研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠陰莖海綿體組織NLRP3 炎性體相關蛋白水平和炎癥細胞因子水平明顯升高。本研究還檢測了陰莖海綿體組織NO 和ET-1 等血管內皮功能指標，結果顯示，高尿酸ED大鼠陰莖海綿體組織ET-1 水平較高而NO 水平較低，其血管內皮功能存在異常，這與NLRP3 介導的炎癥反應有關。本研究結果與之前的幾項研究結果大體一致，氧化應激及炎癥反應介導血管內皮細胞功能損傷，結構發(fā)生改變[11]，對陰莖海綿體血竇的開放造成影響，引發(fā)ED[12]。

中醫(yī)學堅持“整體觀”和“辨證論治”理論，采用中藥辨證組方治療ED 擁有其獨特的療效。高尿酸ED 屬于中醫(yī)學“尿酸濁并陽痿”范疇，課題組前期研究成果認為，痰瘀阻滯在該病的發(fā)生與發(fā)展過程中占主要地位，痰瘀日久入絡，血脈瘀塞，肆虐為患，入臟則窮極及腎，終致腎陽虧虛，是該病的核心病機[13]?；诓C，提出“化痰祛瘀補腎”的治則，并以經方二仙湯為基礎，結合文獻研究中藥治療高尿酸血癥的組方常以清熱利濕、健脾補氣、散結化瘀為主[14]，化裁擬定“化痰祛瘀二仙湯”。方以仙靈脾（又稱為淫羊藿）、仙茅補腎壯陽除濕，薏苡仁健脾除濕，車前子利水祛痰為主，配伍浙貝母化痰散結，地龍祛瘀通絡。現(xiàn)代藥理研究認為薏苡仁、車前子可通過改善腸道菌群結構，影響宿主健康，降低UA[15～16]；淫羊藿是中醫(yī)治療方中常用的補益之品，具有一定抗炎作用，淫羊藿苷可快速由腸道相關菌群代謝為主要活性單體成分淫羊藿次苷Ⅱ[17]，而該成分可有效維持勃起功能[18]。本研究結果與譚樹聰[19]研究結果大體一致，經過祛瘀化痰二仙湯治療后ICP/MAP 升高，大鼠勃起功能得到恢復，陰莖海綿體勻漿組織ET-1 水平降低，NO 水平升高；且伴隨有陰莖海綿體勻漿組織NLRP3 炎性體相關蛋白水平和細胞因子IL-1β、IL-18 水平降低[20]。

綜上所述，祛瘀化痰二仙湯可有效減輕高尿酸血癥ED 大鼠陰莖海綿體血管內皮功能損傷，從而改善勃起功能，其原因可能與方中藥物抑制了陰莖海綿體組織中NLRP3 炎癥小體介導的炎癥反應有關。