吳龍俊云,趙立峰,蘭翼君,趙雯莉,楊波,李也鵬

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫(yī)學院,廣西 百色 533000)

肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中高居首位,并有繼續(xù)上升的趨勢[1]。其中非小細胞肺癌在肺癌中占有很大的比重,達到80%～85%,而作為非小細胞肺癌最常見的病理類型,肺腺癌近年來發(fā)病率持續(xù)上升,早期即可出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移,大部分患者在就診時已是中晚期,預后很差[2-3]。因此,探索肺腺癌新的分子靶點,為肺腺癌患者制定新的治療策略至關重要。作為人肺腺癌上皮細胞系的一員,A549細胞與Ⅱ型肺泡細胞非常相似,包括形態(tài)、結構和代謝產(chǎn)物組成。因此,A549 細胞被廣泛應用于模擬Ⅱ型肺泡細胞反應的研究[4-6]。Sirtuin家族是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶家族。已有研究表明,Sirtuin家族成員具有去乙?；揎椂喾N蛋白的功能,因此其能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,參與細胞基因組穩(wěn)定性、分化、衰老、凋亡、新陳代謝等多種重要的病理、生理過程,進而影響多種腫瘤的形成和發(fā)展過程[7-8]。Sirtuin 6(SIRT6)是Sirtuin家族成員之一,具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、端粒的完整性和維護基因組穩(wěn)定性的作用,在糖尿病、肥胖、心臟病、衰老和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演十分重要的角色[9]。CRISPR/Cas9是一種精準高效的新型編輯技術,Cas9可以對靶基因組進行剪切,形成 DNA 的雙鏈斷裂,DNA修復過程中實現(xiàn)造成移碼突變,使靶標基因失去功能,從而實現(xiàn)基因敲除[10]。本實驗通過CRISPR/Cas9系統(tǒng),借助慢病毒載體構建SIRT6基因敲除的人肺腺癌A549細胞株,將為更深入探索SIRT6在肺腺癌的功能機制提供基礎條件。

1 材料與方法

1.1生物材料 人肺腺癌細胞A549,1640培養(yǎng)基(biosharp)、DMEM 培養(yǎng)基(biosharp)、慢病毒(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)、Polybrene(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)、Primer(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)、Oligo引物(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)。

1.2主要試劑 胎牛血清(biocell)、嘌呤霉素、胰酶、SIRT6抗體、DNA試劑盒、PDVF膜、lip3000。

1.3主要儀器 低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)、化學發(fā)光成像系統(tǒng)(杭州申花科技有限公司)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-rad)、電泳儀(Bio-rad)、倒置顯微鏡(Leica 公司)、PCR儀器(Biometra)、酶標儀(SpectraMax/iD5)。

1.4實驗方法

1.4.1設計靶點的sgRNA序列 利用CRISPR-Cas9靶點制作原理,設計3種不同并符合實驗要求的sgRNA-SIRT6序列(sgRNA-SIRT6-27、sgRNA-SIRT6-28、sgRNA-SIRT6-29),見表1。以設計的sgRNA序列為模板,在模板鏈的5′端添加堿基CACCg,互補鏈的3′端補加堿基C,5′端添加堿基aaac,確保3種sgRNA-SIRT6都能與BbsⅠ酶切后的SIRT6質(zhì)粒形成的黏性末端互補,設計的寡核苷酸鏈合成序列,見表2 。SIRT6單鏈DNA Oligo由上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司設計及合成。

表1 sgRNA序列

表2 sgRNA oligo序列

1.4.2重組質(zhì)粒的構建與鑒定 利用合成的sgRNA-SIRT6 Oligo經(jīng)梯度降溫PCR退火形成雙鏈sgRNA。95 ℃水浴15 min,然后冷卻至室溫,經(jīng)梯度降溫PCR退火形成帶黏性末端的雙鏈sgRNA,將退火產(chǎn)物稀釋200倍使用。由限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切載體質(zhì)粒,取Vector plasmid 1 μL,10X Buffer Tango 2 μL,DTT (20 mM)1 μL,BsmBI 1 μL,加ddH2O補至20 μL,經(jīng)過37 ℃酶切3 h得到線性化載體DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳回收。取線性化的載體DNA 50 ng/μL,退火的雙鏈 DNA 0.5 μL,10×T4 Buffer 1 μL,EG4000 1 μL,T4 DNA Ligase 1 μL,加ddH2O補至10 μL,16 ℃連接3 h獲得酶切連接產(chǎn)物。將酶切連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌TOP10感受態(tài)菌體內(nèi),將其均勻地涂布在含氨芐西林(Amp)的固態(tài)培養(yǎng)基上,24 h后挑取單菌落進行PCR鑒定,得到陽性克隆后測序,得到序列正確的表達sgRNA的過表達慢病毒質(zhì)粒。擴增序列正確的克隆菌液,用中小量質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取質(zhì)粒,送檢測序。

1.4.3sgRNA-SIRT6慢病毒包裝 用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞,以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度約5.0×106細胞/15 mL,接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,待細胞密度達70%～80%時,取SIRT6-sgRNA重組質(zhì)粒DNA溶液16 μg和25 μL Lenti-Easy Packaging Mix與相應體積的Opti-MEM混合均勻,總體積為1.5 mL,室溫下溫育15 min,將混合液滴加入至293T細胞培養(yǎng)液中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),孵育6 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基,緩慢加入含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基 20 mL,于 37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細胞上清液;離心,加入病毒保存液,輕輕反復吹打重懸;離心后取上清液獲得病毒溶液,行滴度測試。

1.4.4sgRNA-SIRT6慢病毒感染細胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 將A549種于6孔板中,細胞量為105。24 h后更換培養(yǎng)基并加入慢病毒進行感染,設置陰性對照,6孔板終體積為2 mL,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入嘌呤霉素篩選細胞,待陰性對照細胞死完,轉(zhuǎn)移細胞到6 cm皿繼續(xù)篩選。取上述少量細胞,DNA提取試劑盒提取DNA并測序,測序引物見表3。細胞正常胰酶消化,吹打成單細胞,移入96,24/6孔板繼續(xù)培養(yǎng),并收取蛋白。

表3 Real-time PCR引物列表

1.4.5單克隆細胞培養(yǎng) 細胞正常胰酶消化,200×g離心5 min后,吹打成單細胞,計數(shù)50個細胞,并將細胞加入到10 mL培養(yǎng)基中,吹打均勻,96孔板每孔加入100 μL細胞懸液,使每孔細胞0.5個左右。24 h后觀察細胞貼壁情況及形態(tài),在單克隆孔中補加100 μL培養(yǎng)基。細胞長滿96孔板按此程序:經(jīng)傳代到24孔板,6孔板到擴大培養(yǎng),并收取蛋白樣品做WB,凍存細胞。

1.4.6Western Blot檢測細胞SIRT6蛋白表達 選取對照A549細胞與過表達的A549細胞,培養(yǎng)24 h后,PBS清洗后用RIPA裂解液提取細胞總蛋白并用BCA法進行蛋白定量,每個樣各取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE 電泳,電泳后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜,濕轉(zhuǎn)120 min,5%BSA 搖床封閉1 h。一抗、二抗孵育,加入曝光底物進行曝光。以GAPDH為內(nèi)參,檢測SIRT6蛋白的表達水平。

2 結果

2.1基因敲除表達載體的鑒定 重組質(zhì)?；驕y序結果顯示在酶切位點之間插入的片段位置、方向及序列分別與3個sgRNA(sgRNA-SIRT6-27、sgRNA-SIRT6-28、sgRNA-SIRT6-29)序列一致,靶向 SIRT6基因的sgRNA序列成功插入載體 ,證明過表達重組質(zhì)粒構建成功。見圖1。

注:A.質(zhì)粒sgRNA-SIRT6-27;B.質(zhì)粒sgRNA-SIRT6-28;C.質(zhì)粒sgRNA-SIRT6-29。

2.2SIRT6敲除的人肺腺癌A549細胞DNA測序鑒定 嘌呤霉素篩選慢病毒感染后細胞,進行單克隆培養(yǎng),提取細胞基因組DNA,并對3個單克隆(SIRT6-27、SIRT6-28、SIRT6-29)進行PCR和測序驗證。測序結果表明3個單克隆擴增的PCR片段大小約為400 bp左右,SIRT6-27和SIRT6-29擴增的PCR片段與原始序列相比,未見堿基改變,而SIRT6-28的PCR片段有明顯的堿基突變,而且峰圖顯示突變點處出現(xiàn)套峰。見圖2。

2.3SIRT6基因敲除后A549細胞內(nèi)SIRT6蛋白表達 將成功敲除SIRT6基因的A549細胞進行單克隆培養(yǎng),收取蛋白進行Western Blot檢測SIRT6蛋白表達,以未感染的A549細胞系作為對照,Western Blot顯示經(jīng)SIRT6基因敲除后的A549細胞內(nèi)SIRT6蛋白不表達,說明 SIRT6基因敲除成功,見圖3。

注:SIRT6-28測序結果與原基因序列比對分析,“▲”表示突變的堿基;“△”表示峰圖出現(xiàn)套峰。

注:蛋白在第一次和第二次背景雜帶多,第三次WB結果正常。

3 討論

SIRT6是一種同時具有單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶、脫脂酰化酶和去乙?；傅亩喙δ艿鞍踪|(zhì),這三種酶促特性構成了SIRT6調(diào)節(jié)各種生理和病理過程的能力的基礎[11]。SIRT6可以通過調(diào)控人體諸多病理、生理過程,從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。一些研究認為,SIRT6是一種抑癌基因。一項在膀胱癌的研究發(fā)現(xiàn),T4分期與T2相比,SIRT6的表達明顯降低,低SIRT6表達增加H3K9的乙?；约癎lut1和PDK1的水平,增強糖酵解,并增加腫瘤細胞的增殖能力[12]。在鼻咽癌中,SIRT6過表達導致抗凋亡蛋白Bcl-2的水平降低,但增加裂解的半胱天冬酶-3和促凋亡蛋白Bax的水平。高水平的SIRT6抑制NF-κB信號傳導并促進鼻咽癌細胞的凋亡[13],而SIRT6在人膠質(zhì)瘤中也被認為是一種抗癌基因[14]。然而,在某些惡性腫瘤中,SIRT6被證實是一種促癌基因。在骨肉瘤中,SIRT6表達上調(diào)增加了腫瘤的復發(fā)風險和死亡風險,是骨肉瘤患者預后不良因素[15]。而在甲狀腺癌的研究也顯示,SIRT6上調(diào)與甲狀腺癌患者的無復發(fā)生存期差以及體外PTC細胞遷移和侵襲增強有關[16]。且SIRT6除了在不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用以外,還可以在同一種腫瘤中發(fā)揮雙重作用。有研究表明,在結腸癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和血液腫瘤中,SIRT6在腫瘤的不同發(fā)育階段或不同細胞系中發(fā)揮著相反的作用[11]。目前,SIRT6在非小細胞肺癌的研究比較廣泛,但在肺腺癌的研究比較少見。WANG J等[17]的研究表明,放療可促進SIRT6蛋白介導的RBBP8脫乙?；陌l(fā)生,進而提高吉非替尼的療效。由此可見,SIRT6在肺腺癌中可能是一種抑癌基因,但是,SIRT6在肺腺癌的作用機制仍未明確。此外,SIRT6在諸多腫瘤中的研究顯示出相互矛盾的結果。因此,構建SIRT6基因敲除的A549細胞系,對于進一步探索SIRT6在肺腺癌的作用機制具有十分重要的意義。

CRISPR/Cas9是一種穩(wěn)定、高效、簡單且廣泛使用的新型基因編輯技術。CRISPR/Cas9在2013年被成功應用于真核生物和細胞之后[18-19],該技術得到了突飛猛進的發(fā)展,目前已被廣泛用于農(nóng)業(yè)[20]、生物材料[21]、醫(yī)學[22]等諸多領域。CRISPR/Cas9作為新興的基因編輯工具,具有操作簡便、編輯高效、通用性廣等優(yōu)勢,因而被廣泛應用于臨床醫(yī)學研究領域。有研究表明,CRISPR/Cas9 技術在惡性腫瘤[23]、心血管系統(tǒng)疾病[24]、免疫系統(tǒng)疾病[25]、遺傳性疾病[26]以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病[27]等臨床醫(yī)學研究領域中取得快速的發(fā)展。尤其在腫瘤診斷和治療方面,CRISPR/Cas9 可以進行腫瘤模型構建、腫瘤演化機制研究、分子診斷、生物治療以及分子靶向藥物的研發(fā)與篩選,為腫瘤的基礎研究和臨床應用提供新的技術保障[28]。毫無疑問,CRISPR/Cas9被證明是一種革命性的工具,在諸多領域的研究顯示出顯著的效果,但其也有自身的局限性。在本實驗中,根據(jù)CRISPR/Cas9技術靶點設計原則,選擇了3個sgRNA進行研究,但最終只有SIRT6-28符合后續(xù)的研究,因此該技術的基因編輯效率有待提高。而其他較為突出的問題是脫靶效應、脫氧核糖核酸損傷毒性和免疫毒性[29],相信隨著科學技術的發(fā)展和自身不斷的完善,CRISPR/Cas9技術的缺陷終將得到改進。

本研究通過CRISPR/Cas9技術,設計并篩選了針對SIRT6敲除的sgRNA,然后將sgRNA-SIRT6序列與載體鏈接,成功構建重組質(zhì)粒并包裝,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細胞中,篩選單克隆細胞進行鑒定。目前鑒定細胞系基因成功敲除的主要方法有3種:①DNA測序結果是否存在基因突變;②Western Blot檢測蛋白是否表達;③實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)檢測細胞mRNA是否表達。部分學者采用單一方法進行驗證基因敲除模型構建是否成功[30],而更多學者選擇其中多種方法進行聯(lián)合鑒定[31-32]。本研究使用了DNA測序和Western Blot檢測蛋白兩種方法聯(lián)合鑒定。測序結果表明PCR片段有明顯的基因突變,而Western Blot結果顯示敲除后的A549細胞內(nèi)無SIRT6蛋白表達,證明敲除SIRT6基因的A549 穩(wěn)定細胞系構建成功。

綜上所述,本研究成功構建了sgRNA-SIRT6重組質(zhì)粒,同時成功敲除了人肺腺癌A549細胞系中的SIRT6基因,為深入研究SIRT6在肺腺癌的作用機制奠定了基礎。