王想,方波,袁昊,米俊豪,謝毓麗,莫泳鋒,楊日榮

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)基因組與個體化醫(yī)學(xué)研究中心,廣西 南寧 530021;2. 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西 南寧 530021;3. 廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開發(fā)應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西 南寧 530021;4. 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530007)

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的蛋白質(zhì)家族。TGF-β信號紊亂不僅是炎癥性疾病的基礎(chǔ),還可以轉(zhuǎn)化正常的成纖維細(xì)胞表型,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[1]。在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中,大量的基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及這些細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子嵌入其中[2]。有研究報道,在胰腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌中,TGF-β可以促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer association fibroblast,CAF)的轉(zhuǎn)化,與預(yù)后不良相關(guān)[3-5]。CAFs作為TME中基質(zhì)的主要成分,分泌多種生長因子、炎性因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,促結(jié)締組織再生反應(yīng),導(dǎo)致不良預(yù)后[6-7]。由于CAFs主要來源于成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,并且肺中有豐富的成纖維細(xì)胞,癌細(xì)胞常傾向于擴(kuò)散到肺[8]。因此,本課題組評價了TGF-β因子刺激下的人成纖維細(xì)胞MRC-5的形態(tài)變化、差異基因的表達(dá)以及參與的主要通路過程。

本次研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)錄組 RNA 測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法,篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),對DEGs的功能和富集的相關(guān)通路進(jìn)行分析,同時構(gòu)建DEGs的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜,篩選出受TGF-β調(diào)控的關(guān)鍵基因在膀胱癌和正常組織中的差異表達(dá)以及生存預(yù)后相關(guān)性,有望作為膀胱癌患者的預(yù)后標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1材料 人成纖維細(xì)胞MRC-5購自上海盈灣生物科技有限公司;MEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司;人TGF-β1重組蛋白購自美國PeproTech公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、建庫試劑盒均購于瑞士羅氏生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞刺激實驗 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)后,取對數(shù)生長期細(xì)胞按照每孔5×104個細(xì)胞種于48孔培養(yǎng)板中,分別設(shè)置Mock培養(yǎng)基組、20 ng/mL TGF-β刺激組進(jìn)行24 h藥物反應(yīng),拍照記錄,收取同批細(xì)胞沉淀,放入-80 ℃冰箱凍存。實驗重復(fù)3次后進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組檢測。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組RNA測序 細(xì)胞經(jīng)裂解后使用包含細(xì)胞條形碼片段(barcode)和唯一分子識別符(UMI)序列的25個核苷酸核苷引物Oligo(dT)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在第一鏈cDNA合成后,經(jīng)過PCR擴(kuò)增,得到互補(bǔ)鏈DNA。將新合成的雙鏈DNA退火到索引引物,致3′末端的DNA生物素化。然后,用超聲波將合成的DNA片段切成300 bp的片段,并用鏈霉親和素C1磁珠孵育連接3′端,隨后將終產(chǎn)物進(jìn)行Qubit濃度檢測,并利用Agilent 2100進(jìn)行進(jìn)一步質(zhì)量檢測。所有測序數(shù)據(jù)在Illumina HiSeq 4000平臺上使用150個堿基對的末端測序產(chǎn)生。

1.2.3差異表達(dá)基因分析 利用R軟件(v4.0.2)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用limma(v3.44.3)分析兩組間差異基因表達(dá)情況,當(dāng)差異倍數(shù)(flod change)大于2,即|log2FC|>1 且矯正P<0.05 時被認(rèn)為是差異顯著的基因。

1.2.4功能富集分析與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用cluster Profiler(v3.16.1)軟件進(jìn)行生物學(xué)過程的注釋(gene ontology,GO)和京都基因和基因組通路富集分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG),并通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)篩選出關(guān)鍵基因(https://string-db.org/,v11.5,2023-2-17)。將PPI導(dǎo)出圖通過cystoscape(v3.9.0)軟件對結(jié)果進(jìn)行美化和分析,按節(jié)點(diǎn)的互作分?jǐn)?shù)設(shè)置色階度進(jìn)行排序,設(shè)置為不同的表現(xiàn)顏色。

1.2.5組織表達(dá)量差異和預(yù)后生存分析 在GEPIA2在線數(shù)據(jù)庫中分析其中5個差異基因在膀胱癌組織與正常組織間RNA表達(dá)量的差異,并對膀胱癌中的3個基因和基因集的表達(dá)進(jìn)行總體生存(overall survival,OS)分析,P<0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)差異(http://gepia2.cancer-pku.cn/)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用R(v4.0.2)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖;采用非參數(shù)檢驗或t檢驗分析兩組間差異,以矯正P或P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1正常成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β的刺激情況 光鏡下觀察體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞MRC-5為梭形,其形態(tài)尚可依細(xì)胞的功能變化和物理性狀不同而發(fā)生改變。經(jīng)過24 h培養(yǎng)后,TGF-β處理組細(xì)胞較Mock組形態(tài)細(xì)長,生長速度快,但貼壁情況差異不明顯(見圖1)。隨后,我們收集3次重復(fù)實驗的兩組細(xì)胞沉淀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

2.2轉(zhuǎn)錄組文庫的成功構(gòu)建 Qubit檢測樣本cDNA濃度為23.8 ng/μL,Agilent 2100檢測樣本文庫,主峰為354 bp,同時在900～2000 bp;1000～5000 bp 占比大于15%;300 bp以下片段占比小于40%。質(zhì)量合格,進(jìn)行上機(jī)檢測(見圖2)。

2.3DEGs分析 通過對兩組細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析,以差異倍數(shù)≥2且矯正P<0.05繪制火山圖和層次聚類圖,共篩選出161個差異基因,包括39個上調(diào)基因和122個下調(diào)基因(見圖3)。

注:圖中比例尺為100 μm

圖2 構(gòu)建細(xì)胞文庫質(zhì)檢圖譜

注:A.差異基因火山圖(綠色表示下調(diào),紅色表示上調(diào)),圖中基因均為矯正P有意義的基因;B.差異表達(dá)

2.4GO功能富集分析 通過GO富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在GO生物學(xué)過程(biological process,BP)中TGF-β主要影響的是神經(jīng)元凋亡、壞死過程,核苷磷酸生物合成過程,嘌呤核糖核苷磷酸代謝過程,核糖核苷磷酸生物合成過程和核糖核苷磷酸代謝過程。富集基因數(shù)量相對較多的細(xì)胞成分(cellular component,CC)主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體、甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體、過氧化體基質(zhì)和酶體、微體管腔以及細(xì)胞器、線粒體大核糖體亞基。生物學(xué)功能(molecular function,MF)主要是結(jié)合信號序列(見圖4A)。

2.5KEGG通路富集分析 對DEGs進(jìn)行KEGG通路富集,發(fā)現(xiàn)這些信號主要涉及核苷酸生物合成,核苷磷酸代謝,神經(jīng)元凋亡、壞死和肽基-賴氨酸修飾等過程(見圖4B)。

注:A.差異基因 GO 生物學(xué)過程富集分析排名前10位的注釋情況;B.差異基因KEGG 通路富集分析

2.6蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 通過在線數(shù)據(jù)庫STRING 中的Multiple Protein構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),以P<0.05 為篩選條件時,154個 DEGs 編碼的蛋白能夠形成復(fù)雜的PPI(見圖5)。而根據(jù)相互作用網(wǎng)絡(luò)中蛋白與蛋白之間連接的節(jié)點(diǎn)數(shù),篩選出受TGF-β調(diào)控的6個潛在關(guān)鍵基因CAT、GFM1、MRPS18B、RRP12、RRS1、CASP3。

注:互作分?jǐn)?shù)越高,顏色標(biāo)記越紅。

2.7TCGA數(shù)據(jù)庫中差異基因表達(dá)和BLCA患者預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)文獻(xiàn)查詢,DEGs中篩選出TGF-β調(diào)控的潛在關(guān)鍵基因TGFB1I1、HYOU1與膀胱癌的惡性程度和預(yù)后顯著相關(guān)[9-10]。將差異表達(dá)分析和PPI篩選的潛在關(guān)鍵基因放入TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行膀胱癌組織和正常組織對比,發(fā)現(xiàn)TGFB1I1、COL16A1在BLCA組織表達(dá)量較低;HYOU1、ZWLCH基因在BLCA組織相對表達(dá)上調(diào)(見圖6A;P<0.01)。其中,TGFB1I1和CAT高表達(dá)時,對BLCA患者生存有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖6B;P<0.05),并且當(dāng)3個基因同時高表達(dá)時,BLCA患者的生存期較短(見圖6C;P<0.05),潛在說明TGF-β刺激的成纖維細(xì)胞群與膀胱癌患者生存預(yù)后顯著相關(guān),可能是治療的潛在靶點(diǎn)。

3 討論

本研究通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG的富集分析,發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集在核苷酸合成、代謝的信號通路。由于核苷酸在人體內(nèi)廣泛分布,其主要生物學(xué)功能應(yīng)當(dāng)不容忽視,主要包括:①核苷酸是核酸的基本單位,可以儲存能量,主要通過三磷酸核苷酸實現(xiàn),特別是ATP,是給予細(xì)胞能量的主要形式。另外,一些活化的中間產(chǎn)物,如UDP-葡萄糖,亦含有核苷酸成分。②核苷酸可以參與生理和代謝調(diào)節(jié):cAMP(或cGMP)是多種細(xì)胞膜激素受體的調(diào)節(jié)作用的第二信使,許多代謝過程也要受到體內(nèi)ATP、ADP或AMP水平的調(diào)節(jié)。③核苷酸可以組成輔酶。如腺苷酸可作為NAD+、ANDP+、FMN、FAD及CoA等的組成成分[11]。此外,核苷酸還可在轉(zhuǎn)錄水平上受一系列主要轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,亦在酶水平上受到變構(gòu)調(diào)節(jié)和反饋抑制的調(diào)節(jié),同時也參與細(xì)胞周期中的代謝和調(diào)節(jié)機(jī)制[12]。近年來,藥物對腫瘤微環(huán)境的影響還尚不清楚,非腫瘤細(xì)胞在腫瘤免疫微環(huán)境中的代謝脆弱性被尤為關(guān)注[13]。因此,針對癌癥核苷酸的合成與代謝的有關(guān)成纖維細(xì)胞的研究仍值得探索。

注:A.TCGA數(shù)據(jù)中TGFB1I1、COL16A1、HYOU1、ZWLCH、CAT 5個基因在膀胱癌與正常組織中的表達(dá)水平差異(紅色表示膀胱癌,灰色表示正常);B.GEPIA2分析TGFB1I1、HYOU1、AT單基因高低表達(dá)對膀胱癌患者生存率的影響;C.TGFB1I1、HYOU1、CAT基因組合高低表達(dá)對膀胱癌患者生存率與生存分析關(guān)系。

本研究通過對PPI和生存預(yù)后的分析,還發(fā)現(xiàn)TGFB1I1、HYOU1和CAT等基因出現(xiàn)在多條富集的信號通路上,與多種生物學(xué)機(jī)制相關(guān)。TGFB1I1(也稱為Hic-5)編碼一種局部黏附支架蛋白,先前已被證明TGFB1I1與膀胱癌血管發(fā)育、細(xì)胞黏附及細(xì)胞外基質(zhì)的形成有關(guān),并與細(xì)胞外基質(zhì)受體途徑相關(guān)的基因有很強(qiáng)的相關(guān)性[10]。除此之外,TGFB1I1的表達(dá)還與巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞呈正相關(guān)。巨噬細(xì)胞在上調(diào)Ⅵ型膠原的合成和組裝,誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積等方面發(fā)揮著重要作用,研究者推測TGFB1I1還參與了浸潤性免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)沉積之間的相互作用[14]。這可能與TGFB1I1在BLCA中都較正常組織更低表達(dá),影響患者預(yù)后顯著相關(guān)聯(lián);HYOU1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白,屬于HSP70家族,在缺氧、缺糖、還原劑和衣霉素等應(yīng)激條件下誘導(dǎo)表達(dá)[15]。HYOU1抗細(xì)胞凋亡作用主要包括:①抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡通路;②HYOU1和ER應(yīng)激感應(yīng)器的結(jié)合可能使它們保持不活躍,從而抑制UPR;③激活A(yù)kt磷酸化作為生成磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一部分[16],膀胱癌中該基因的表達(dá)很可能也參與了以上的生物學(xué)過程;作為過氧化氫酶的CAT基因是人體內(nèi)一種天然的、很重要的抗氧化酶,在活性氧的清除過程中作為超氧化物歧化酶的下游抗氧化蛋白,通過催化超氧陰離子自由基的自身氧化還原反應(yīng),有效清除自由基,維持體內(nèi)自由基和氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡,來避免損傷機(jī)體的組織細(xì)胞[17]。同時,心血管危險因素常常導(dǎo)致由NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、線粒體電子傳輸鏈和功能障礙的內(nèi)皮型一氧化氮合酶產(chǎn)生的活性氧物種的增加,超過抗氧化防御系統(tǒng)(如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、血紅素加氧酶、對氧磷酶)的能力時,會導(dǎo)致氧化應(yīng)激,從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成,目前CAT也已成為心血管疾病研究的候選基因[18]。除此之外,過氧化氫酶C262T的變異與不同癌癥之間的聯(lián)系也被廣泛報道,CAT C262T變異與總體癌癥易感性有關(guān),還可能與血液、骨髓、胃腸道、前列腺癌、皮膚癌和婦科癌癥有關(guān)[19-20]。這些數(shù)據(jù)更加提示了差異基因TGFB1I1、HYOU1和CAT的表達(dá)可以調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展,影響癌癥患者預(yù)后,可能是BLCA一個潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)或預(yù)后監(jiān)測指標(biāo),但還需多中心的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗證。