李雪頎,周青宏,潘春風(fēng),王語(yǔ)陽(yáng),蘇拾香,岑蘭英,潘路娟,覃月秋

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000)

胰腺癌是一種死亡率極高的惡性腫瘤,因其早期診斷率低,確診常常已延誤最佳治療時(shí)機(jī)、預(yù)后不良[1]。最常見(jiàn)的胰腺癌類型是胰導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),其往往由胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanINs)和導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤(IPMN)的增生性病變等癌前病變演化而來(lái)[2]。近年來(lái),全世界胰腺癌的發(fā)病率和死亡率都在逐年增加,盡管診斷和治療手段都有了新的發(fā)展,但確診后五年生存率卻僅為5%,約80%的患者無(wú)法接受外科治療。即便進(jìn)行了早期手術(shù)切除,術(shù)后五年生存率也僅為15%～25%[3]。胰腺癌的預(yù)后情況差,一方面與早期診斷率低有關(guān),另一方面,胰腺癌細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的反應(yīng)差,因此放療、化療及免疫療法等常規(guī)治療方案效果均不理想[4]。

沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin 1,SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶,是sirtuins蛋白家族中的一員,大小約為80 kDa左右,作為一種核酶,SIRT1廣泛存在于身體各器官的細(xì)胞中,因其對(duì)老化、自噬 、凋亡、炎癥等調(diào)節(jié)的作用突出而受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注,亦被稱為“長(zhǎng)壽蛋白”[5]。SIRT1抑制凋亡的作用可以導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的分裂[6]。在關(guān)于胰腺癌相關(guān)的研究中,SIRT1通常被認(rèn)為可以通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的凋亡等方式影響其耐藥性[7]。

miR-9-5p在癌細(xì)胞相關(guān)的研究中被報(bào)道,可以通過(guò)調(diào)控NF-κB通路表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)[8],在巨噬細(xì)胞中,miR-9-5p通過(guò)抑制SIRT1來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB通路[9]。然而,miR-9-5p通過(guò)SIRT1/NF-κB通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程在胰腺癌中的作用機(jī)制少見(jiàn)報(bào)道。本研究探討miR-9-5p調(diào)控SIRT1通過(guò)NF-κB通路對(duì)PDAC細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞凋亡的影響,這將為胰腺癌的診斷及治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胰腺癌PANC-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;青-鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司,構(gòu)建miR-9-5p過(guò)表達(dá)慢病毒載體,并完成包裝、滴度的測(cè)定(載體類型:GV慢病毒載體系列,熒光標(biāo)記:EGFP);質(zhì)粒、嘌呤霉素均購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司;qRT-PCR引物、miRNA第一鏈cDNA合成(莖環(huán)法)均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;X-tremegene HP購(gòu)于上海羅氏制藥公司;SYBR Master Mix擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;opti-MEM、Trizol、mRNA第一鏈cDNA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司;ELISA試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;蛋白酶抑制劑混合物、一抗稀釋液、二抗稀釋液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、20×TBST、封閉液、彩虹Marker均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PAGE凝膠快速制備試劑盒、Omni-EasyTM速溶型蛋白上樣緩沖液(變性,還原型,5×)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;SIRT1抗體、NF-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體、Caspase-3抗體、β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam;兔抗鼠IgG HRP購(gòu)自Affinity;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millpore公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 PANC-1細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),使用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。將PANC-1細(xì)胞接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%融合度時(shí),將慢病毒加入孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分組如下:mimic組,轉(zhuǎn)染miR-9-5p過(guò)表達(dá)慢病毒;NC組,轉(zhuǎn)染空載體慢病毒;空白組,不轉(zhuǎn)染慢病毒。轉(zhuǎn)染12 h更換新鮮培養(yǎng)基,24 h后開(kāi)始表達(dá)綠色熒光,72 h熒光表達(dá)最強(qiáng),在熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率,最后用嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選。

1.2.2qRT- PCR 轉(zhuǎn)染24 h后用Trizol提取各組細(xì)胞RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。使用賽默飛逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以β-actin作為miR-9-5p、SIRT1和NF-κB p65的內(nèi)參,qRT-PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 300 s,變性95 ℃ 10 s,退火/延伸60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用2-△△Ct法來(lái)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,引物見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)各基因引物序列

1.2.3Western Blot 在各組細(xì)胞中加入含有1%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液冰上裂解35 min,在4 ℃條件下,12 000 r/min離心15 min, 取上清置于EP管中, 通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定各組樣品蛋白的濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液, 沸水煮沸15 min,以30 μg蛋白濃度進(jìn)行PAGE凝膠電泳,常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜后,5%牛血清白蛋白封閉2 h,分別用1∶1 000的鼠抗兔單克隆抗體GAPDH、1∶20 000的鼠抗兔單克隆抗體SIRT1、 1∶1 000鼠抗兔的單克隆抗體Caspase-3的一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次, 每次10 min,IgG-HRP標(biāo)記的鼠抗兔二抗4 ℃搖床孵育2 h,TBST洗滌3次, 每次10 min,后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析,用SIRT1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3蛋白條帶與GAPDH灰度值的比值計(jì)算各自的相對(duì)表達(dá)量,計(jì)算p-NF-κB p65與NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量的比值。

1.2.4ELISA 將各組細(xì)胞在T25中培養(yǎng)至大約70%融合度時(shí),用胰酶裂解后,離心收集細(xì)胞,PBS洗滌3次后超聲裂解細(xì)胞,隨后反復(fù)凍融使細(xì)胞漲破,隨后4 ℃ 1500×g 離心10 min,收集上清,用ELISA法分別測(cè)量后進(jìn)行分析,操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將構(gòu)建的SIRT1 3′UTR-WT(含SIRT1 3′UTR片段)和SIRT1 3′UTR-MUT(含SIRT1′UTR片段突變體)的熒光素酶報(bào)告載體,采用X-tremegene HP分別將SIRT1 3′UTR-WT和SIRT1 3′UTR-MUT與miR-9-5p mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h,按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)操作,記錄螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值,以兩者的比值評(píng)價(jià)SIRT1基因的激活程度。

2 結(jié)果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染情況 培養(yǎng)PANC-1細(xì)胞至融合度為50%左右,開(kāi)始慢病毒轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染條件為MOI=10時(shí),轉(zhuǎn)染24 h后,綠色熒光開(kāi)始表達(dá),72 h綠色熒光表達(dá)最強(qiáng),熒光顯微鏡下拍照,細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的綠色熒光,細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好,如圖1所示。

注:A、C、E分別為白光下mimic組、NC組和空白組的細(xì)胞形態(tài);

2.2各組細(xì)胞miR-9-5p、SIRT1、Caspase-3 mRNA表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2A～圖2C),與空白組及NC組相比,mimic組miR-9-5p表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01),SIRT1的表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01),Caspase-3表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)。

注:A.各組細(xì)胞miR-9-5p相對(duì)表達(dá)量;B.各組細(xì)胞SIRT1相對(duì)表達(dá)量;

2.3Western Blot法檢測(cè)SIRT1、NF-κB通路相關(guān)蛋白、Caspase-3蛋白的表達(dá) Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3A～圖3C),與空白組及NC組相比,mimic組SIRT1的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01),p-NF-κB p65與NF-κB p65蛋白表達(dá)比值顯著上調(diào)(P<0.01),Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)。

2.4ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中SIRT1與Caspase-3蛋白的表達(dá)量 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞裂解液結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4A、圖4B),與空白組及NC組相比,mimic組SIRT1的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)。

2.5miR-9-5p、SIRT1、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析 使用Pearson相關(guān)分析對(duì)miR-9-5p、SIRT1、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖5),miR-9-5p與SIRT1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.849,P<0.05);miR-9-5p與Caspase-3的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.796,P<0.05)。

注:A.各組細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)量;B.各組細(xì)胞p-NF-κB p65與NF-κB p65蛋白表達(dá)量

注:A.各組細(xì)胞裂解液中SIRT1蛋白表達(dá)量;

圖5 miR-9-5p、SIRT1、Caspase-3

2.6miR-9-5p靶向SIRT1 在Target Scan Human數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè) miR-9-5p與SIRT1存在結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖6A),熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖6B)顯示轉(zhuǎn)染野生型SIRT1基因表達(dá)載體WT-SIRT1后,相較于miR-NC對(duì)照組, SIRT1過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01);而轉(zhuǎn)染突變型SIRT1基因表達(dá)載體MUT-SIRT1后,相較于miR-NC對(duì)照組,miR-9-5p過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著。可見(jiàn),miR-9-5p可靶向調(diào)控SIRT1的表達(dá)。

注:A.SIRT1的3’UTR中含有與miR-9-5p互補(bǔ)的核

3 討論

胰腺癌因早期診斷難度大,預(yù)后不良,成為近年來(lái)死亡率極高的惡性腫瘤之一。目前,有關(guān)于胰腺癌的相關(guān)機(jī)制仍然沒(méi)有完全闡明。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡機(jī)制在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后方面都具有非常重要的作用。研究表明,細(xì)胞凋亡過(guò)程在胰腺癌進(jìn)程中被抑制[10],這是由于胰腺癌細(xì)胞的凋亡必須經(jīng)過(guò)線粒體的增強(qiáng)作用,但調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)信號(hào)的Bcl-2蛋白失衡,使得信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)偏向抗凋亡的方向。因此,如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為一種新的胰腺癌治療方向,并逐漸受到重視[11]。

凋亡是一種細(xì)胞內(nèi)在的自殺程序,可能由內(nèi)源性和外源性刺激觸發(fā)。Caspase是在其活性中心含有半胱氨酸的蛋白酶,并且能夠切割蛋白質(zhì),其中Caspase-3,6和7屬于下游效應(yīng)物,可以切割底物?；贑aspase在細(xì)胞死亡的執(zhí)行階段扮演重要的角色,將其稱為細(xì)胞凋亡介質(zhì)[4]。許多關(guān)于胰腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究都以Caspase-3作為凋亡標(biāo)志物,在凋亡增加的情況下其表達(dá)上調(diào)[12-14]。在本研究中,Caspase-3表達(dá)水平上調(diào),與前人的研究一致。

SIRT1是一種NAD+依賴心脫乙酰酶,是sirtuins蛋白家族中的一員,作為一種核酶,SIRT1廣泛存在于身體各器官的細(xì)胞中,因其對(duì)老化、自噬 、凋亡、炎癥等調(diào)節(jié)的作用突出而受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注,亦被稱為“長(zhǎng)壽蛋白”。SIRT1可以調(diào)控多種信號(hào)通路,如NF-κB、PGC1α、FoxOs等,而這些信號(hào)通路通常出現(xiàn)在與衰老相關(guān)的機(jī)制研究當(dāng)中[5]。SIRT1抑制凋亡的作用可以導(dǎo)致Caspase-3的分裂[6],ZHAO G等[15]通過(guò)對(duì)比胰腺癌細(xì)胞與癌旁細(xì)胞標(biāo)本發(fā)現(xiàn)SIRT1在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá),敲低SIRT1后,細(xì)胞凋亡增加。同樣的,在ZHAO G等[16]的研究中,過(guò)表達(dá)SIRT1可以逆轉(zhuǎn)多個(gè)胰腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞衰老與凋亡趨勢(shì)。上述研究說(shuō)明SIRT1有抑制細(xì)胞凋亡的作用。在本研究中,mimic組的SIRT1表達(dá)降低,同時(shí)Caspase-3表達(dá)上升,說(shuō)明下調(diào)SIRT1表達(dá)可能使凋亡增加,這與前人的研究結(jié)果一致。

miRNA-9(miR-9)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的非編碼RNA?，F(xiàn)有的對(duì)miR-9的研究認(rèn)為,miR-9在多種細(xì)胞中均可發(fā)揮多重功能。在腎上腺細(xì)胞中,重金屬污染物誘導(dǎo)miR-9-5p上調(diào),將會(huì)通過(guò)PI3K/AKP途徑引起腎上腺細(xì)胞凋亡繼而導(dǎo)致組織損傷[17]。miR-9對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的作用因其組織細(xì)胞的來(lái)源而異。在大部分癌癥細(xì)胞中,miR-9均呈低表達(dá),并呈現(xiàn)一定的抑癌作用[18-19]。CHEN X R等[20]通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,miR-9-5p可以通過(guò)促進(jìn)癌癥細(xì)胞凋亡,增加其對(duì)抗癌藥物替莫唑胺的敏感性。在胰腺癌中,miR-9-5p低表達(dá)并被證實(shí)可以靶向GOT1抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲、增殖和谷氨酰胺代謝[21]。在本研究中,與空白組相比,mimic組在miR-9-5p上調(diào)的情況下,表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)增加,這表示miR-9-5p誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)生。

在胰腺癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中,NF-κB通路發(fā)揮了十分重要的作用。NF-κB通路的激活通常分為兩種通路:規(guī)范通路也稱為經(jīng)典通路,反應(yīng)迅速且可逆,IκB被磷酸化從而失活,p50/p65二聚體與IκBα分離,穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核,并與DNA結(jié)合[22]。另一種途徑稱為非規(guī)范通路或替代通路,其依賴于IKKα二聚體激活p52與RelB,與經(jīng)典通路相比激活緩慢,且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)[23]。在大多數(shù)胰腺癌患者中,組成NF-κB的RalA被激活,可以調(diào)控癌細(xì)胞的侵襲、生長(zhǎng)、增殖、化學(xué)抗性等[5,24-25],而SIRT1作為一種去乙酰酶,可以靶向作用于NF-κB蛋白,從而抑制其下游通路活性,誘發(fā)細(xì)胞凋亡[26]。在本研究中,與空白組及NC組相比,mimic組的p-NF-κB p65蛋白與NF-κB p65蛋白比值明顯升高,提示通路被激活,同時(shí)凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)增加,這與前人的研究一致。

目前,關(guān)于胰腺癌細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚,miR-9-5p是否靶向SIRT1,調(diào)控NF-κB通路影響胰腺癌細(xì)胞凋亡,少見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息分析發(fā)現(xiàn)miR-9-5p與SIRT1之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn),并通過(guò)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn),miR-9-5p通過(guò)靶向SIRT1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程在帕金森病中已經(jīng)被證實(shí)[27],SIRT1靶向NF-κB通路引發(fā)細(xì)胞凋亡的過(guò)程亦在大鼠神經(jīng)細(xì)胞里得到了佐證[28]。本研究通過(guò)進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-9-5p與SIRT1確實(shí)存在靶向關(guān)系。由此,本研究推斷在胰腺癌細(xì)胞中,miR-9-5p靶向SIRT1/NF-κB這一通路可以調(diào)控Caspase-3的表達(dá)。為證實(shí)這一推測(cè),本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立miR-9-5p過(guò)表達(dá)PANC-1細(xì)胞,探討這幾項(xiàng)指標(biāo)之間的相互關(guān)系。結(jié)果證實(shí),mimic組miR-9-5p過(guò)表達(dá)的同時(shí),SIRT1 mRNA及蛋白低表達(dá),p-NF-κB p65蛋白與NF-κB p65蛋白比值明顯升高,Caspase-3 mRNA及蛋白升高,提示這幾者之間存在潛在關(guān)系。為明確miR-9-5p與SIRT1及凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)的相互關(guān)系,我們進(jìn)一步進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析,結(jié)果顯示miR-9-5p與SIRT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān);miR-9-5p與Caspase-3表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上,胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與癌細(xì)胞的凋亡有關(guān),SIRT1作為去乙酰酶參與調(diào)控了胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程,且受到miR-9-5p的負(fù)調(diào)控。過(guò)表達(dá)miR-9-5p可能靶向SIRT1/NF-κB通路, 促進(jìn)凋亡標(biāo)志物Caspase-3的表達(dá),這將為胰腺癌的診斷與治療提供新的思路。