王琛琛 郭彩茹 牛宇杰 王 皓 續(xù) 暢 亓 民

[1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院臨床基因與細(xì)胞工程中心,北京市 100038;2 河南省腫瘤免疫與再生醫(yī)學(xué)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室(鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院),河南省洛陽(yáng)市 471009;3 洛陽(yáng)市心腦組織損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南省洛陽(yáng)市 471009;4 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥物及醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu),北京市 100038]

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和繼發(fā)血栓形成導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈供血減少或中斷,進(jìn)而引起嚴(yán)重的心肌缺血和心肌壞死。心肌梗死的病理過程不可逆轉(zhuǎn)且預(yù)后極差,已成為影響人類健康的主要問題[1]。急診冠狀動(dòng)脈介入治療和溶栓治療等干預(yù)雖然可以在一定程度上減輕心肌損傷,但因無法修復(fù)壞死心肌而難以獲得最佳治療效果。隨著再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程不斷推進(jìn),干細(xì)胞的再生潛能為心肌再生提供了可能[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)具有多向分化潛能,有助于受損心肌細(xì)胞的修復(fù)或再生,阻止心臟重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生,在此過程中BMSC的旁分泌功能發(fā)揮重要作用[3-5]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞成分的自我降解,其通過細(xì)胞膜包裹衰老、受損或失去功能的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器,形成自噬溶酶體后降解包裹的內(nèi)容物,為細(xì)胞代謝提供原料,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的存活。自噬對(duì)維持心肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要[6]。BMSC對(duì)缺血再灌注修復(fù)的作用機(jī)制目前尚未明確,細(xì)胞自噬可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。據(jù)此,本研究擬通過將BMSC與H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞間接共培養(yǎng),探討B(tài)MSC修復(fù)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的機(jī)制,并分析細(xì)胞自噬在該過程中的作用,從而為心肌再灌注損傷的治療提供新思路,為預(yù)防和逆轉(zhuǎn)缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展提供理論與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:SD大鼠BMSC[賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司,貨號(hào):RASMX-01001];大鼠心肌細(xì)胞H9c2(上海富衡生物科技有限公司,貨號(hào):FH1004)。

1.1.2 主要試劑:高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(貨號(hào):R0010)、CCK-8試劑盒(貨號(hào):CA1210)、AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒(貨號(hào):CA1020)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):PC0020)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;3% H2O2購(gòu)自Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司(貨號(hào):102131391);FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒(貨號(hào):KR118)、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(貨號(hào):FP205)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;TRIzol總RNA提取試劑盒(貨號(hào):R0016)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)B兔多克隆抗體(貨號(hào):AL221)、Beclin-1兔多克隆抗體(貨號(hào)AF5123)、GAPDH 兔多克隆抗體(貨號(hào):AF1186)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào):A0192)均購(gòu)自北京碧云天科技有限公司。

1.1.3 主要儀器:微量核酸檢測(cè)儀(Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):NanoDrop 2000);酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司,型號(hào):VICTOR X3);流式細(xì)胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號(hào):BD FACSCanto Ⅱ);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司,型號(hào):StepOnePlus);電泳儀(Bio-Rad公司,型號(hào):Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Systems);蛋白轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad公司,型號(hào):Bio-Rad Mini Trans-Blot);凝膠成像儀(上海天能科技有限公司,型號(hào):Tanon 5200 Multi)。

1.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)基:大鼠BMSC的培養(yǎng)使用SD大鼠BMSC完全培養(yǎng)基[賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司,貨號(hào):RASMX-90011];大鼠心肌細(xì)胞H9c2的培養(yǎng)使用含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,貨號(hào):11011-6125)和1%青霉素-鏈霉素雙抗的低糖DMEM(HyClone公司,貨號(hào):SH30021.01)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):取出大鼠心肌細(xì)胞H9c2和大鼠BMSC,復(fù)蘇后接種于相應(yīng)培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d換液1次,待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),選擇第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞模型的濃度篩選:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠心肌細(xì)胞H9c2按5×104個(gè)/mL、100 μL/孔接種在24孔板中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),次日使用PBS清洗,用含1%胎牛血清的低血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后,更換為終濃度含0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、500 μmol/L、700 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基,分別孵育6 h、9 h、12 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度,細(xì)胞活力=給藥組吸光度值/0 μmol/L H2O2組吸光度值×100%。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠心肌細(xì)胞H9c2按5×104個(gè)/mL、1 000 μL/孔接種在24孔板中,并將細(xì)胞分成H2O2組、BMSC+H2O2組、對(duì)照組,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。取出H2O2組和BMSC+H2O2組的24孔板,加入500 μmol/L的H2O2處理12 h以建立氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞模型;使用PBS清洗細(xì)胞3次后加入低糖DMEM(300 μL/孔),將兩組的24孔板置于Transwell小室,然后在兩組的小室中加入低糖DMEM(200 μL/孔),BMSC+H2O2組的小室中同時(shí)加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠BMSC(1×105個(gè)/mL、200 μL/孔);將兩組小室置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。取出對(duì)照組的24孔板并置于Transwell小室,在小室中加入低糖DMEM(200 μL/孔),然后將小室置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:取干預(yù)24 h后的各組細(xì)胞,用0.25%胰酶溶液消化,收集至流式管中,以1 200 r/min離心5 min,棄上清液。加入4 ℃預(yù)冷的PBS重懸,1 200 r/min離心5 min,棄上清液,依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC及5 μL PI,混勻后避光孵育20 min,然后加入300 μL結(jié)合緩沖液重懸。于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況:取干預(yù)24 h后的各組細(xì)胞,用0.25%胰酶溶液消化,12 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞沉淀,用PBS沖洗3次,5 min/次,采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,使用微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定總RNA濃度,按照FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成,按照SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。引物由深圳華大基因股份有限公司合成,引物序列見表1。反應(yīng)體系包括2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,正向引物(10 μmol/L)0.6 μL、反向引物(10 μmol/L)0.6 μL、cDNA模板1.5 μL、50×ROX Reference Dye 2 μL、RNase-free ddH2O 5.3 μL,總共20 μL。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Beclin-1、LC3B的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況:取干預(yù)24 h后的各組細(xì)胞,用25%胰酶溶液消化,然后加入高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取80 μg蛋白,進(jìn)行12% SDS-PAGE(60～80 V)分離蛋白,然后在300 mA、90 min的條件下將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h。分別加入5 μL LC3B兔多克隆抗體(稀釋比為1 ∶1 000)、5 μL Beclin-1兔多克隆抗體(稀釋比為1 ∶1 000)、5 μL GAPDH兔多克隆抗體(稀釋比為1 ∶800),4 ℃孵育過夜;TBST洗膜4次,10 min/次;加入5 mL辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(稀釋比為1 ∶1 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜(同上)。以GAPDH為內(nèi)參,ECL顯影成像后利用Quantity One軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞模型的濃度和干預(yù)時(shí)間篩選結(jié)果 不同濃度H2O2干預(yù)不同時(shí)間后,大鼠心肌細(xì)胞H9c2活力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中,在500 μmol/L H2O2干預(yù)12 h時(shí),細(xì)胞活力約為50%,較能體現(xiàn)藥效差異,且多次造模結(jié)果穩(wěn)定,見表2。因此選取500 μmol/L H2O2處理12 h的方法構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞模型。

表2 不同濃度H2O2干預(yù)后大鼠心肌細(xì)胞H9c2活力的比較(x±s,%)

2.2 3組大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡情況的比較 干預(yù)24 h后,與對(duì)照組相比,H2O2組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與H2O2組相比,BMSC+H2O2組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖1和表3。

圖1 3組大鼠心肌細(xì)胞H9c2的凋亡情況

表3 3組大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡率的比較(x±s,%)

2.3 3組大鼠心肌細(xì)胞H9c2自噬相關(guān)基因表達(dá)情況的比較 干預(yù)24 h后,與對(duì)照組、H2O2組比較,H2O2+BMSC組Beclin-1和LC3B mRNA表達(dá)水平均升高(均P<0.05)。見表4。

表4 3組Beclin-1和LC3B mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 3組大鼠心肌細(xì)胞H9c2自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況的比較 干預(yù)24 h后,H2O2組Beclin-1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組,LC3B蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05);與對(duì)照組、H2O2組比較,BMSC+H2O2組Beclin-1蛋白和LC3B蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。見表5和圖2。

表5 3組Beclin-1、LC3B蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 3組Beclin-1蛋白和LC3B蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

研究表明,缺血再灌注產(chǎn)生的過量活性氧簇主要是來自線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)鏈[7-8],這些活性氧簇可直接損傷生物分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA),也可通過促凋亡途徑間接引起生物分子損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí),BMSC可修復(fù)缺血再灌注受損的心肌細(xì)胞,改善心臟功能[10-11]。此外,BMSC旁分泌的趨化因子、抗炎因子、生長(zhǎng)因子、外泌體等,通過發(fā)揮抗炎、抗凋亡、促進(jìn)新生血管再生等作用對(duì)梗死心肌進(jìn)行修復(fù),從而改善心臟功能[12]。本研究采用H2O2誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2建立氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞模型,探討B(tài)MSC修復(fù)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的途徑。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,H2O2組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與H2O2組相比,BMSC+H2O2組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。由此可見,BMSC可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,這與既往研究結(jié)果[13]相似。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解過程,在減小梗死面積、保護(hù)心肌細(xì)胞和維持左心室功能方面發(fā)揮重要作用[14-16]。許多研究表明,缺氧性或缺血性損傷后自噬增強(qiáng)可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷[17-20],心肌細(xì)胞自噬水平的上調(diào)可以減輕缺血再灌注損傷[21-22]。而在缺血后的再灌注期間,活性氧簇的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致細(xì)胞自噬功能障礙[23]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組、H2O2組比較,H2O2+BMSC組Beclin-1、LC3B mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05),表明BMSC可通過提高心肌細(xì)胞的自噬水平來發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述,BMSC可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)心肌細(xì)胞自噬水平,來減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。BMSC對(duì)心肌細(xì)胞自噬水平的促進(jìn)作用雖未得到更多的研究證實(shí),但其對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用已有較多的相關(guān)報(bào)告[24-26]。BMSC通過哪種途徑調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的自噬與凋亡,以及具體的作用機(jī)制如何,還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。