蔡銀鏈,王圣楠,王耀國(guó),徐 玲

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,福建 泉州 362000)

病毒性心肌炎屬于感染性心肌病,其特征為心肌彌漫性或局限性病變,病毒感染是導(dǎo)致該病的重要原因,最為常見(jiàn)的病毒為柯薩奇B3 病毒(Coxsackievirus B3, CVB3)[1]。當(dāng)前臨床上仍缺少有效的針對(duì)性治療手段,多數(shù)患者及時(shí)治療后可痊愈,但也有少量患者因病毒性心肌炎急性發(fā)作導(dǎo)致心律失常、心力衰竭等情況[2]。

MitoQ是一種線粒體靶向抗氧化劑,近年來(lái)被證實(shí)在腫瘤、腦線粒體氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[3, 4]。此外,其在心臟保護(hù)中的作用也逐漸被揭示,如李鵬等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)MitoQ能夠抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體功能障礙[5]。此外也有研究證實(shí)MitoQ能夠抑制高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞鐵死亡以及心肌細(xì)胞焦亡[6]。另外有關(guān)于MitoQ和CVB3的研究發(fā)現(xiàn),MitoQ能夠抑制線粒體活性氧并且抑制CVB3的復(fù)制[7]?？紤]到CVB3是導(dǎo)致心肌炎的一個(gè)重要原因,我們推測(cè)MitoQ可能在病毒性心肌炎中發(fā)揮作用。

本研究通過(guò)CVB3誘導(dǎo)的方式構(gòu)建病毒性心肌炎小鼠模型,旨在探討MitoQ在病毒性心肌炎治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性BALB/c 小鼠均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2012-0002];CVB3病毒由武漢大學(xué)病毒研究所贈(zèng)予;MitoQ購(gòu)自美國(guó)Focus biomolecules公司;HE染色試劑盒(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)購(gòu)自上海碧云天;BCA試劑盒(HR0329)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;Bax抗體(ab216494)、Bcl-2抗體(ab196495)、GAPDH抗體(ab8245)均購(gòu)自英國(guó)ABCAM;ECL顯影液(WBKIS0100購(gòu)自Millipore;ROS(E004-1-1)和SOD試劑盒(A001-3-2)購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TNF-α的ELISA試劑盒(E-EL-M3060)以及IL-6的ELISA試劑盒(E-MSEL-M0001)購(gòu)自Elabscience公司。

1.2 CVB3處理小鼠構(gòu)建病毒性心肌炎動(dòng)物模型

購(gòu)買雄性BALB/c 小鼠50只,借助隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組、病毒性心肌炎組、MitoQ(2 mg/kg)組、MitoQ(4 mg/kg)組、MitoQ(8 mg/kg)組,每組10只。對(duì)照組小鼠通過(guò)腹腔注射的方式給予2 mL 0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)注射7天。另外4組腹腔注射0.2 mL含1.0×106滴度的CVB3病毒以構(gòu)建病毒性心肌炎模型,腹腔注射病毒6 h后MitoQ治療組小鼠繼續(xù)腹腔注射不同濃度MitoQ,處理時(shí)間7天,之后采用5%濃度戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,之后斷頸處死小鼠并且取小鼠心臟和血清標(biāo)本。

1.3 HE染色檢測(cè)小鼠心肌病理情況

將留取的各組小鼠心肌組織在4%多聚甲醛固定24 h,PBS沖洗。脫水以及石蠟包埋組織后制成蠟塊并且依據(jù)HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)要求行HE染色。由我院資深病理科醫(yī)師對(duì)各組心肌組織炎癥分布情況進(jìn)行評(píng)分:無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)記為0分,炎性浸潤(rùn)面積低于25%記為1分,炎性浸潤(rùn)面積在大于等于25%并低于50%記為2分,炎性浸潤(rùn)面積大于等于50%并低于75%記為3分,炎性浸潤(rùn)面積大于等于75%并低于100%記為4分[8]。

1.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組小鼠心肌組織并研磨,之后加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解并且冰上反應(yīng)30 min。12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心,BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。取50μg蛋白樣本行10%SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,TBST溶液進(jìn)行阻斷。加入一抗Bax、Bcl-2,4℃下過(guò)夜孵育。次日在室溫下復(fù)蘇1h,TBST沖洗后添加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG孵育2小時(shí),TBST沖洗。ECL顯影,Image J對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行量化分析,根據(jù)GADPH蛋白值進(jìn)行歸一化。

1.5 試劑盒檢測(cè)心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

收集各組小鼠心肌組織,剪碎后置于冰上勻漿,依據(jù)ROS和SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組小鼠心肌組織中ROS和MDA水平進(jìn)行測(cè)定。

1.6 ELISA法檢測(cè)血清心肌損傷標(biāo)志物和炎性因子水平

ELISA法對(duì)小鼠血清中肌鈣蛋白I(Troponin I,cTnI)、B 型腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平以及炎性因子(TNF-α、IL-6)的水平。取出各組血清樣本并在室溫放置1 h,4℃條件下以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,之后取上清液并且依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)cTnI、BNP、TNF-α、IL-6的水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS23.0軟件進(jìn)行,計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。兩組間差異比較采用t檢驗(yàn),單因素方差分析法與Tukey事后檢驗(yàn)用于多組間數(shù)據(jù)比較。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MitoQ對(duì)病毒性心肌損傷的影響

HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1),對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞完整、形態(tài)正常,可見(jiàn)排列整齊的心肌纖維且不存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而模型組小鼠心肌細(xì)胞大量壞死、細(xì)胞核形狀改變,炎性因子大量覆蓋。隨著MitoQ劑量的增加,心肌細(xì)胞病理學(xué)變化逐漸改善,心肌細(xì)胞壞死、斷裂溶解減少。對(duì)比各組病理反應(yīng)評(píng)分發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,病毒性心肌炎組病理評(píng)分增加,隨著MitoQ劑量的增加病理評(píng)分也逐漸減少(F=284.8,P<0.0001)。

圖1 HE染色結(jié)果觀察和各組病理評(píng)分

2.2 各組小鼠血清cTnI 和BNP 水平比較

與對(duì)照組比較,病毒性心肌炎組小鼠血清cTnI、BNP 水平均增加(均P<0.05);而與病毒性心肌炎組比較,MitoQ治療組小鼠血清cTnI、BNP水平隨MitoQ濃度的增加呈劑量依賴性降低(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清cTnI 和BNP 水平

2.3 MitoQ影響心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子水平

Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,相較于對(duì)照組,病毒性心肌炎組凋亡促進(jìn)因子Bax表達(dá)升高而凋亡抑制因子Bcl-2則顯著下調(diào)(P<0.05);另外與病毒性心肌炎組比較,隨著MitoQ劑量增大,凋亡促進(jìn)因子Bax表達(dá)水平下降,而凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)水平則逐漸上升。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠心肌組織Bax和Bcl-2水平

2.4 各組小鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平比較

與對(duì)照組比較,病毒性心肌炎組小鼠心肌組織ROS水平增加,SOD水平降低(均P<0.05)。MitoQ用藥組小鼠隨著MitoQ劑量的增加,ROS水平逐漸降低,SOD水平逐漸增高(均P<0.05)。見(jiàn)表3。表明MitoQ能夠改善病毒性心肌炎小鼠心肌組織氧化應(yīng)激。

表3 各組小鼠心肌組織ROS和SOD水平

2.5 各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

與對(duì)照組比較,病毒性心肌炎組小鼠血清TNF-α、IL-6水平均增加(均P<0.05);而相較于病毒性心肌炎組,MitoQ治療組小鼠血清TNF-α、IL-6水平隨MitoQ濃度的增加呈劑量依賴性降低(均P<0.05)。見(jiàn)表4。提示MitoQ能夠抑制病毒性心肌炎小鼠心肌炎性反應(yīng)。

3 討論

病毒性心肌炎多發(fā)于兒童以及40歲以下青年,尋找能夠有效抑制病毒感染導(dǎo)致的病毒性心肌炎的藥物也具有重要意義[9]。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了線粒體靶向藥物MitoQ能夠抑制病毒性心肌炎小鼠心肌損傷并且減少炎性反應(yīng)。

本研究首先通過(guò)CVB3感染的方式構(gòu)建了病毒性心肌炎小鼠模型,之后又使用MitoQ對(duì)小鼠進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)MitoQ能夠改善心肌炎小鼠心肌組織病理?yè)p傷。cTnI和BNP是心肌損傷標(biāo)志物,被證實(shí)與心功能情況有關(guān)[10,11]。而本研究使用MitoQ干預(yù)病毒性心肌炎小鼠后,小鼠血清cTnI、BNP 水平降低,這也提示MitoQ對(duì)心肌損傷的改善作用。

心肌細(xì)胞在人體中屬于不可再生細(xì)胞的一種,因此其凋亡程度與心功能也存在密不可分的關(guān)系,抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)于心臟保護(hù)具有十分重要意義[8]。本研究對(duì)各組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)因子的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)病毒性心肌炎小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)因子Bax的表達(dá)顯著上調(diào)而凋亡抑制因子Bcl-2水平被抑制,提示了MitoQ對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡的改善作用。

MitoQ作為一種線粒體靶向抗氧化劑,其發(fā)揮作用的重要途徑就是通過(guò)自由穿透線粒體,抑制ROS水平從而實(shí)現(xiàn)抗氧化和抑制疾病進(jìn)展的作用[12]。本研究對(duì)各組小鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相較于病毒性心肌炎小鼠,MitoQ能夠抑制ROS水平增加,促進(jìn)抗氧化因子SOD水平提高。另外炎性因子檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了MitoQ在抑制小鼠血清炎性因子中的作用。

綜上所述,本研究證實(shí)了MitoQ在改善病毒性心肌炎小鼠心肌組織損傷,抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)中的價(jià)值,對(duì)于病毒性心肌炎的治療具有重要意義。