劉 仔,張 麗,鄺惠珍,李俊杰

(東莞市中醫(yī)院藥學部,廣東 東莞 523127)

一項基于5000萬人口全國城鎮(zhèn)職工基本醫(yī)療保險數(shù)據(jù)的調(diào)查顯示,在我國≥25歲人群中HF的年齡標準化患病率是1.10%,預估現(xiàn)有患病人數(shù)達1210萬,每年新發(fā)病患者300萬[1]。美國一項對來自254家醫(yī)院39982名HF患者進行的風險調(diào)整生存分析發(fā)現(xiàn),射血分數(shù)下降的心衰(EF≤40%)、射血分數(shù)臨界的心衰(EF 41%to 49%)、射血分數(shù)保留的心衰HFpEF住院患者5年死亡率分別是75.3%、75.7%、75.7%[2]。降低HF患者死亡率、穩(wěn)定病情、提高生存質量成為臨床關注的重點和難點。

HF現(xiàn)有治療藥物主要是腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑(ACEI/ARB/ARNI)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑、利尿劑等。雖然心衰治療現(xiàn)代理念和手段在不斷進步,但在西醫(yī)治療基礎上,針對不同心衰階段的不同證型加用中醫(yī)治療,可有效改善慢性心衰患者臨床癥狀和生活質量,維持心功能,減少再住院率[3]。

本研究以全面系統(tǒng)收集整理HF相關靶點為切入點,基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法,尋找潛在中藥及活性化合物,構建疾病-靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡,探討中醫(yī)藥治療HF的藥效物質基礎,以期為臨床治療HF及相關藥學研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 心力衰竭相關作用靶點收集

登錄GeneCard、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)平臺,以“heart failure”為關鍵詞進行檢索,獲得HF相關{Wang,2021#1}靶點,并使用UniProt匹配靶點全稱。

1.2 候選化合物篩選及靶點-化合物網(wǎng)絡構建

檢索TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[4]收集與HF靶點相關的化合物信息。根據(jù)ADME參數(shù)及Lipinski規(guī)則對候選化合物進行篩選。通過查詢文獻對刪除的化合物活性進行逐一確認,補充相關活性化合物。以上所得化合物視為候選化合物。使用Cytoscape 3.8.0構建潛在靶點-候選化合物網(wǎng)絡。

1.3 中藥篩選及靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡構建

檢索TCMSP收集含有候選化合物的中藥,構建化合物-中藥網(wǎng)絡,結合靶點-化合物網(wǎng)絡,利用Cytoscape3.8.0構建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡并計算網(wǎng)絡中各節(jié)點的拓撲學參數(shù)以確定關鍵節(jié)點,初步評估中藥及相關化合物對HF的調(diào)節(jié)作用。

1.4 中藥類別及性味歸經(jīng)分析

查詢2020版《中華人民共和國藥典》[5]、第3版《全國中草藥匯編》[6]、全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材第十一版《中藥學》獲取“1.3”項下中藥類別及性味歸經(jīng)信息,并進行頻數(shù)統(tǒng)計分析。在上述資料中無相關信息時不予統(tǒng)計該藥。

1.5 靶點-候選化合物分子對接

選取“靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡”中度值排名前5位的核心靶點作為受體,與網(wǎng)絡中的核心成分進行分子對接。

查詢RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.pdbus.org/),選取5種蛋白的晶體結構。使用AutoDock Tools 1.5.6及PyMOL 2.3對蛋白晶體、化合物進行刪除原始配體、去水、加氫等前處理,保存為.pdbqt格式文件。運用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接,預測蛋白質受體與化合物配體的結合模式和結合能值。

2 結果

2.1 心力衰竭相關靶點

通過GeneCard、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫分別獲得HF相關靶點54、133、65、109個,將靶點去重處理并經(jīng)UniProt規(guī)范,獲得HF相關靶點323個,查詢TCMSP有對應化合物的靶點有69個,經(jīng)ADME及Lipinski規(guī)則篩選后所得化合物對應的靶點有35個,分別是ADRA2C、ADRB1、ADRB2、PTGS2、SCN5A、CHRM4、KCNH2、IL6、LTA4H、TNF、NR3C2、BIRC5、CXCL2、CYP1A1、CYP3A4、GJA1、HIF1A、HSF1、MAPK1、MMP2、MMP3、PPARG、TP53、XDH、CYP2C9、EDN1、ECE1、BMPR2、CD36、CES1、ACLY、NOX1、FOSL1、OLR1、SLC12A1,將它們定義為潛在靶點。

2.2 候選化合物及靶點-化合物網(wǎng)絡

經(jīng)檢索TCMSP平臺,323個HF靶點中有69個能關聯(lián)到中藥成分,關聯(lián)化合物共計4090個。關聯(lián)化合物經(jīng)過ADME參數(shù)及Lipinski規(guī)則篩選,并通過查詢文獻補充4個活性化合物,共篩選得到891個候選化合物。構建潛在靶點與候選化合物的靶點-化合物網(wǎng)絡,得到度值前9的化合物為槲皮素、丹參酮ⅡA、木犀草素、胡椒堿、卡維丁、異胡椒脂堿、牡丹草堿、育亨賓堿、隱丹參酮,這些化合物可作用于多個HF相關靶點而具有較強活性,可考慮對其進一步深入研究。度值排前9的靶點為PTGS2、SCN5A、ADRB2、KCNH2、NR3C2、CHRM4、ADRA2C、ADRB1、LTA4H,分別對應735、395、267、163、133、87、45、43、35個化合物,與HF發(fā)生機制相關性較高,可作為進一步研究的主要靶點。

2.3 匹配中藥及靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡

891個候選化合物在TCMSP平臺關聯(lián)得到445味中藥,根據(jù)關聯(lián)關系構建化合物-中藥網(wǎng)絡。其中度值前11的中藥為甘草、丹參、鉤藤、黃芩、延胡索、板藍根、降香、半枝蓮、苦參、白屈菜、苦地丁,分別含候選化合物65、43、29、27、26、22、22、21、21、19、19個。通過候選化合物橋接作用統(tǒng)計關聯(lián)靶點數(shù)≥24的中藥有21個,分別為銀杏葉、延胡索、白果、半枝蓮、大棗、甘草、紅芪、黃柏、黃連、金盞菊花、沒藥、木蝴蝶、青蒿、沙棘、山楂葉、土茯苓、菟絲子、夏枯草、香附、洋金花、皂角刺,推測這21種中藥對HF有干預作用,可為臨床遣方用藥及試驗研究提供支撐信息。

對關聯(lián)靶點數(shù)≥24的中藥及其關聯(lián)化合物、靶點構建網(wǎng)絡,見圖1。圖中節(jié)點大小與度值正相關,圓形代表化合物,菱形代表靶點,六邊形代表中藥。

圖1 靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡圖(中藥關聯(lián)靶點數(shù)≥24)

2.4 中藥類別及性味歸經(jīng)

對445味中藥的類別及性味歸經(jīng)進行頻數(shù)統(tǒng)計分析。結果顯示潛在可干預HF的中藥類別以清熱藥(17.3%)、補虛藥(11.6%)、化痰止咳平喘藥(10.6%)、解表藥(8.5%)、利水滲濕藥(7.9%)、活血化瘀藥(7.0%)、理氣藥(7.0%)為主,上述七類中藥累計占比69.9%。藥味頻率較高者為苦、辛、甘,藥性寒溫并重。歸經(jīng)方面,肝經(jīng)占比最高(47.0%),其次為肺經(jīng)(38.0%)、胃經(jīng)(30.8%),具體頻次見圖2。

圖2 干預心力衰竭中藥歸經(jīng)分布

2.5 分子對接結果

30個核心成分(Degree≥6)與5個核心靶點PTGS2(PDB ID:5IKQ)、SCN5A(PDB ID:4DCK)、ADRB2(PDB ID:6PS2)、KCNH2(PDB ID:6SYG)、NR3C2(PDB ID:3VHV)的對接得分見對接得分熱圖3。

圖3 干預心力衰竭潛在核心成分與核心靶點分子對接得分熱圖

150組對接組合中,有99組為靶點-化合物網(wǎng)絡中的組合,其中有60組Affinity<-7.0 kcal/mol,對接得分最高的是PTGS2-alpha-berbine(-10.0 kcal/mol),得分最低的是KCNH2-leonticine(-5.4 kcal/mol),網(wǎng)內(nèi)99個組合平均對接得分-7.5 kcal/mol,表明潛在核心成分與核心靶點之間可能有較好的對接活性。51組網(wǎng)外組合中,有20組Affinity<-7.0 kcal/mol,Affinity前3位的是NR3C2-luteolin(-9.1 kcal/mol)、NR3C2-6-Methoxyflavone(-9.1 kcal/mol)、NR3C2-fisetin(-9.0kcal/mol)。

綜合考慮分子對接Affinity值及成分在網(wǎng)絡中的度值,選擇其中4組進行可視化展示,見圖4。

A:PTGS2與quercetin分子對接模型

3 討論

中醫(yī)用藥講究臨證化裁,加上中藥成分具有復雜性,對人體疾病的調(diào)節(jié)往往是多靶點、多通路的,網(wǎng)絡藥理學可系統(tǒng)、整體、高效的分析疾病與藥物涉及靶點的相關性,有助于揭示中醫(yī)藥治療心衰的藥效物質基礎和作用機制。

本文對HF靶點進行了較為全面的收集整理,篩選出35個潛在靶點,其中能關聯(lián)較多候選化合物的靶點有PTGS2、SCN5A、ADRB2、KCNH2、NR3C2、CHRM4、ADRA2C、ADRB1等,已有研究表明這些靶點與HF之間存在相關性。例如由PTGS2編碼的環(huán)氧合酶2(COX2)在非缺血性HF患者中具有高表達水平[7]。SCN5A編碼的電壓門控鈉離子通道(Nav1.5)是心臟中表達的主要電壓門控鈉通道,該通道通過產(chǎn)生快速鈉內(nèi)流啟動心臟動作電位,Nav1.5功能障礙與包括HF在內(nèi)的多種先天性或獲得性心臟病相關[8]。

本研究在全面收集整理HF靶點的基礎上,篩選出能作用于較多HF靶點的化合物有槲皮素、丹參酮ⅡA、木犀草素、隱丹參酮等。有研究表明,槲皮素可能通過SIRT5促進IDH2的去琥珀酸化,維持線粒體穩(wěn)態(tài),保護炎癥狀態(tài)下的小鼠心肌細胞,并改善心肌纖維化,從而降低HF的發(fā)生率[9]。丹參酮ⅡA通過抑制細胞凋亡和激活AMPK-mTOR信號通路誘導自噬保護心肌細胞并改善心臟功能,抑制氧化應激改善HF大鼠的心功能障礙和纖維化[10]。

為更深一步評估上述核心靶點及成分之間的結合活性,本研究利用計算機分子對接技術做了進一步驗證。所選取的度值排名靠前的核心靶點與核心成分的分子對接結果顯示,大多數(shù)靶點-化合物網(wǎng)絡內(nèi)的成分和靶點之間有著強結合力,進一步驗證了本文構建的靶點-化合物網(wǎng)絡具有一定的預測意義,可為進一步研究中藥治療HF的有效成分提供參考。

通過構建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡,得到了能映射較多HF靶點的銀杏葉、延胡索、白果、半枝蓮等21種中藥,推測這些中藥對HF具有干預作用。

在中藥類別分析部分有意思的是,頻次靠前中藥還出現(xiàn)了清熱藥、解表藥,并且清熱藥占比最高,這些清熱藥、解表藥在治療HF方面是否真正具有臨床應用價值及如何讓HF患者獲益尚值得進一步研究。性味歸經(jīng)方面,潛在可干預HF的中藥藥味以苦、辛、甘為多,歸經(jīng)以肝、肺經(jīng)為主。性味歸經(jīng)頻數(shù)分析結果與中醫(yī)治療HF時使用益氣養(yǎng)陰或益氣溫陽固本,活血、利水、化痰治標的治療大法相一致,可為進一步解釋中醫(yī)藥治療HF的作用機制提供參考。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡藥理學、數(shù)據(jù)挖掘及分子對接等研究方法,較為系統(tǒng)的探討了中醫(yī)藥治療HF可能的物質基礎及用藥規(guī)律,可為臨床治療HF及相關藥學研究提供參考。但因為本研究數(shù)據(jù)基本來源于網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫及通過軟件計算所得,后續(xù)可嘗試選取映射靶點多的中藥,通過實驗對其發(fā)揮抗HF作用的物質基礎、藥理作用、量效關系等作進一步研究。