王靜 唐玲 肖婷

研究表明,缺血再灌注可引發(fā)心肌組織強(qiáng)烈炎癥及氧化應(yīng)激,并導(dǎo)致過度自噬,造成心肌細(xì)胞凋亡,是導(dǎo)致心律失常的主要病理基礎(chǔ),減輕炎癥、自噬及氧化應(yīng)激,是缺血-再灌注心律失常的一種有效治療策略[1－3]。利多卡因是一種鈉通道阻滯劑,可有效改善急性心肌梗死(簡稱心梗)患者心功能,減輕其心律失常癥狀[4],但其藥理機(jī)制目前尚未見明確報(bào)道。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號(hào)可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、自噬等生理過程,在缺血-再灌注心律失常的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。激活PI3K/AKT 信號(hào),可減少炎癥因子的產(chǎn)生,降低氧化應(yīng)激水平,抑制心肌細(xì)胞凋亡,改善心律失常癥狀[5－6],并通過抑制過度自噬而減輕心肌缺血-再灌注損傷[7]。研究表明利多卡因能通過增強(qiáng)PI3K/AKT 信號(hào)通路表達(dá)降低心力衰竭大鼠炎性因子合成釋放,抑制其心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心臟功能[8],因而激活PI3K/AKT 信號(hào)可能是利多卡因治療缺血-再灌注心律失常的藥理機(jī)制。筆者探究利多卡因?qū)θ毖?再灌注心律失常的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)SD 大鼠購自廣州銳格生物科技有限公司[SCXK(粵)2021-0059],體重均為190～230 g,雄性,6周齡左右,在本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng),動(dòng)物房溫度設(shè)在23～25℃,濕度設(shè)在50%～60%,并嚴(yán)格按照?中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例?進(jìn)行動(dòng)物管理及實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑鹽酸利多卡因注射液(規(guī)格1.8 ml:36 mg,國藥準(zhǔn)字H20013390)購自黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司;PI3K/AKT 信號(hào)抑制劑LY294002(純度:99.87%,貨號(hào)HY-10108)購自美國MCE 公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(貨號(hào)A003-1-2)、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)G001-1-1)、BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(貨號(hào)C503021)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測定試劑盒(貨號(hào)A005-1-2)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)測定試劑 盒(貨 號(hào) E004-1-1)、RIPA 裂 解 液(貨 號(hào)C500005)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)試劑盒(貨號(hào)H372-1)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號(hào)D751014)均購自南京建成生物工程研究所有限公司;兔源Anti-LC3一抗(貨號(hào)ab179463)、兔源Anti-AKT 一 抗(貨 號(hào)ab179463)、兔 源Anti-Beclin1一抗(貨號(hào)ab138364)、兔源Anti-p-PI3K 一抗(貨 號(hào)ab138364)、兔 源 Anti-Bax 一 抗(貨 號(hào)ab151549)、兔源Anti-PI3K 一抗(貨號(hào)ab151549)、兔源Anti-caspase-9一抗(貨號(hào)ab38449)、兔源Anti-p-AKT 一抗(貨號(hào)ab38449)、羊抗兔二抗(貨號(hào)ab150077)、兔源Anti-GAPDH(貨號(hào)ab181602)一抗均購自美國Abcam 公司等。

1.3 缺血-再灌注心律失常模型制備及分組取SD 大鼠,參照文獻(xiàn)[9]制備缺血-再灌注心律失常模型:腹腔注射40 mg/kg的3%戊巴比妥鈉溶液,待大鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)時(shí),將其仰臥位綁縛固定在操作板上,氣管插管后,連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào)Kent,肯特企業(yè)集團(tuán)公司)做機(jī)械通氣,并以十六道生理參數(shù)分析記錄儀(型號(hào)GY-6168B,河南華南醫(yī)電科技有限公司)觀察監(jiān)視大鼠心電變化,將大鼠前胸脫毛、備皮、消毒后開胸,暴露心臟后,游離肺動(dòng)脈,于其圓錐旁出針并穿過心肌表層,進(jìn)行結(jié)扎,阻斷冠狀動(dòng)脈血流,當(dāng)大鼠左心室前壁出現(xiàn)紫紺,心電圖ST 段顯著抬高,表示心肌缺血成功,30 min后去除結(jié)扎線,恢復(fù)血流灌注2 h即表示造模成功完成,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將鹽酸利多卡因注射液、LY294002 均以0.9%氯化鈉溶液稀釋,得到0.4、0.8 mg/ml的利多 卡 因 藥 液[10]、利 多 卡 因(0.8 mg/ml)和LY294002(1.0 mg/ml)的混合藥液[11]。

SD 大 鼠 共70 只,用 于 構(gòu) 建 模 型 大 鼠58 只(7只死亡,3只未達(dá)到構(gòu)模標(biāo)準(zhǔn)),檢測左室收縮壓(112.62±11.36)mm Hg,心 率(338.14±22.58)次/分,將建模后心肌缺血成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、利多卡因低劑量(4 mg/kg)組、利多卡因高劑量(8 mg/kg)組、利多卡因(8 mg/kg)＋PI3 K 抑 制(10 mg/kg)組,每 組12 只,另 取12 只大鼠只開胸暴露心臟,不結(jié)扎肺動(dòng)脈,作為假手術(shù)組,心肌缺血成功后各組依組別馬上進(jìn)行給藥處理:利多卡因低劑量與高劑量組大鼠分別腹腔注 射10 m L/kg劑 量 的0.4、0.8 mg/m L 利 多 卡因藥液;利多卡因＋PI3 K 抑制組大鼠以10 m L/kg的劑量腹腔注射利多卡因(0.8 mg/m L)和PI3 K 抑 制 劑LY294002(1.0 mg/m L)的 混 合 藥液;假手術(shù)組與模型組大鼠腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液,每組給藥處理1 次后恢復(fù)血流灌注。

1.4 心律失常檢測及標(biāo)本采集恢復(fù)血流灌注2 h后,以十六道生理參數(shù)分析記錄儀記錄大鼠心電圖,打開應(yīng)用程序,輸入組別、鼠號(hào),設(shè)置低通濾波為600 Hz,屏速調(diào)為100 mm/s,選擇1-5通道,連接5組導(dǎo)聯(lián)線,正極接到大鼠右上肢,負(fù)極接到大鼠左下肢,地線接到右下肢,觀察并記錄大鼠心電變化,獲得大鼠心電圖,根據(jù)心電圖波形變化分析得到大鼠心室顫動(dòng)(簡稱室顫)持續(xù)時(shí)間與1 min內(nèi)室性早搏(簡稱室早)次數(shù)。然后以1.3中方法麻醉大鼠,以注射器采集頸動(dòng)脈血,4℃下以3000 rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15 min,將血清吸出在－80℃保存;頸椎脫臼處死大鼠,開胸取出心臟,以手術(shù)剪剪下0.4 g,加入生理鹽水冰水浴中勻漿,4℃下以3000 rpm/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,將上清吸出保存在－80℃,以手術(shù)剪再剪下心肌組織0.9 g,加入RIPA 裂解液冰水浴中勻漿,4℃下以3000 rpm/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,將上清吸出在－80℃保存,剩余的心肌組織經(jīng)包埋后置于液氮中凍成塊狀,取出放入冰凍切片機(jī)(型號(hào)FS800,深圳市瑞沃德生命科技有限公司)中切片備用。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測取1.4中的大鼠心肌組織切片,復(fù)溫后置于預(yù)冷后的丙酮中固定,以試劑盒進(jìn)行TUNEL染色,具體按照試劑盒說明書指導(dǎo)步驟進(jìn)行,采用光學(xué)顯微鏡(型號(hào)DSX100,日本奧林巴斯株式會(huì)社)觀察封片后的心肌組織著色情況,凋亡細(xì)胞被染成棕色或深棕色,拍照后以Image-J軟件分析計(jì)算出心肌細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 血清iNOS、PGE2 及心肌組織氧化應(yīng)激因子測定取1.4中的頸動(dòng)脈血清與心肌組織上清液,提前放置在冰水浴中解凍,采用試劑盒中試劑并通過酶標(biāo)儀(型號(hào)2010ELX-808,美國Bio Tek 公司)測量血清iNOS、PGE2水平及心肌組織中氧化應(yīng)激因子GSH-Px、ROS、MDA 水平,具體按照試劑盒說明書指導(dǎo)步驟進(jìn)行。

1.7 心肌組織凋亡、自噬與PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)情況檢測 取1.4中的心肌組織蛋白樣品液,以BCA 試劑盒測出各組蛋白總濃度后將其調(diào)至相同,每組取20μL煮沸變性,以蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(型號(hào)170-4070,美國Bio-Rad公司)進(jìn)行電泳與濕轉(zhuǎn),獲得分離開的蛋白,以5%脫脂奶粉封閉其非特異位點(diǎn),兔源Anti-Bax、Anti-caspase-9、Anti-Beclin1、Anti-LC3、Anti-AKT、Anti-p-PI3K、Anti-PI3K、Anti-p-AKT、Anti-GAPDH 一抗孵育,洗膜,羊抗兔二抗孵育,洗膜,化學(xué)發(fā)光法顯色,拍照,Image-J軟件分析定量各蛋白灰度值,經(jīng)統(tǒng)計(jì)后得到其相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s))表示,采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,假手術(shù)組和模型組之間比較進(jìn)行t檢驗(yàn);多組間比較進(jìn)行單因素方差分析,多組間進(jìn)一步兩兩比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心律失常的比較與假手術(shù)組相比,模型組室顫持續(xù)時(shí)間和室早次數(shù)顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,利多卡因低劑量與高劑量組大鼠室顫持續(xù)時(shí)間和室早次數(shù)均降低(P＜0.05);與利多卡因低劑量組相比,利多卡因高劑量組大鼠室顫持續(xù)時(shí)間和室早次數(shù)降低(P＜0.05);與利多卡因高劑量組相比,利多卡因＋PI3 K抑制組大鼠室顫持續(xù)時(shí)間和室早次數(shù)升高(P＜0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠心電圖檢測

表1 各組大鼠室顫持續(xù)時(shí)間和室早次數(shù)

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的比較與假手術(shù)組相比,模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,利多卡因低劑量與高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率均降低(P＜0.05);與利多卡因低劑量組相比,利多卡因高劑量組、心肌細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05);與利多卡因高劑量組相比,利多卡因＋PI3K 抑制組心肌細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)。圖2、表2。

表2 各組大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡率/%

圖2 各組大鼠心肌組織TUNEL染色結(jié)果(×200)

2.3 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激與炎癥的比較與假手術(shù)組相比,模型組心肌組織GSH-Px水平顯著降低(P＜0.05),心肌組織ROS及MDA 水平、血清炎癥因子iNOS 及PGE2水平顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,利多卡因低劑量與高劑量組心肌組織GSH-Px水平均升高(P＜0.05),心肌組織ROS及MDA 水平、血清炎癥因子iNOS 及PGE2水平均降低(P＜0.05);與利多卡因低劑量組相比,利多卡因高劑量組心肌組織GSH-Px水平均升高(P＜0.05),心肌組織ROS及MDA 水平、血清炎癥因子iNOS及PGE2水平均降低(P＜0.05);與利多卡因高劑量組相比,利多卡因＋PI3K 抑制組心肌組織GSH-Px水平均降低(P＜0.05),心肌組織ROS及MDA 水平、血清炎癥因子iNOS及PGE2水平均升高(P＜0.05)。表3。

表3 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激因子GSH-Px、ROS、MDA 水平及血清炎癥因子iNOS、PGE2 水平

2.4 各組大鼠心肌組織凋亡、自噬與PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較與假手術(shù)組相比,模型組心肌組織凋亡蛋白caspase-9及Bax表達(dá)水平、自噬蛋白LC3II/LC3I與Beclin-1表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),PI3K/AKT 通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,利多卡因低劑量與高劑量組心肌組織凋亡蛋白caspase-9及Bax 表達(dá)水平、自噬蛋白LC3II/LC3I與Beclin-1表達(dá)水平均降低(P＜0.05),PI3K/AKT通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平均升高(P＜0.05);與利多卡因低劑量組相比,利多卡因高劑量組心肌組織凋亡蛋白caspase-9及Bax表達(dá)水平、自噬蛋白LC3II/LC3I與Beclin-1表達(dá)水平降低(P＜0.05),PI3K/AKT 通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平升高(P＜0.05);與利多卡因高劑量組相比,利多卡因＋PI3K 抑制組心肌組織凋亡蛋白caspase-9 及Bax 表達(dá)水平、自噬蛋白LC3II/LC3I與Beclin-1表達(dá)水平升高(P＜0.05),PI3K/AKT 通 路 蛋 白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水 平降低(P＜0.05)。圖3、表4。

表4 各組大鼠心肌組織凋亡、自噬與PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平

圖3 免疫印跡檢測大鼠心肌組織凋亡、自噬與PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

心梗在世界范圍內(nèi)發(fā)生率不斷增加,心律失常作為其誘發(fā)的最常見并發(fā)癥,可使心?；颊咝墓δ車?yán)重受損,引發(fā)心力衰竭,對(duì)人們生命安全的威脅與日俱增,已成為當(dāng)前急需解決的臨床難題[1－2]。本文通過結(jié)扎大鼠肺動(dòng)脈使心肌缺血后再灌注,構(gòu)建缺血-再灌注心律失常模型,結(jié)果顯示,心肌缺血-再灌注大鼠炎性細(xì)胞因子大量產(chǎn)生,引發(fā)嚴(yán)重的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng),造成心肌細(xì)胞大量凋亡,導(dǎo)致室顫、室早等心律失常,揭示缺血-再灌注心律失常模型構(gòu)建成功。

利多卡因被證實(shí)參與調(diào)控修復(fù)心功能,提高心?；颊叽婊盥?改善心律失常癥狀[12－13]。筆者以不同劑量利多卡因處理缺血-再灌注心律失常大鼠,發(fā)現(xiàn)利多卡因可降低心肌組織ROS 及MDA、血清iNOS及PGE2水平,升高心肌組織GSH-Px水平,清除氧自由基,降低炎癥因子水平,增強(qiáng)抗氧化能力,抑制心肌細(xì)胞凋亡,緩解心肌損傷,減輕室顫、室早等心律失常癥狀。筆者的結(jié)果與既往報(bào)道相似,且高劑量利多卡因的療效更強(qiáng),進(jìn)一步證實(shí)了利多卡因的抗心律失常作用,但具體的作用機(jī)理有待進(jìn)一步探索。

炎癥、氧化應(yīng)激和自噬是急性心梗后心肌損傷及心律失常的重要病理因素,增強(qiáng)抗氧化活性,減輕心臟炎癥及自噬,可顯著改善心梗后心功能損傷,降低心律失常發(fā)生率[2－3]。PI3K/AKT 是調(diào)控組織細(xì)胞自噬、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)及炎癥的重要信號(hào),在缺血-再灌注心肌損傷及心律失常的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,促使PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo),可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥減輕心肌細(xì)胞凋亡及心肌過氧化損傷,進(jìn)而改善心律失常,修復(fù)心功能[14－15],并能減弱過度缺血/再灌注引發(fā)的心肌自噬,進(jìn)而減輕心肌損傷[7],筆者推測利多卡因可能通過激活PI3K/AKT 信號(hào),參與改善缺血-再灌注引發(fā)的心律失常,結(jié)果顯示,缺血-再灌注心律失常大鼠心肌組織p-PI3 K/PI3 K及p-AKT/AKT水平顯著降低,自噬蛋白LC3II/LC3I與Beclin-1表達(dá)水平顯著升高,以利多卡因處理后,可增強(qiáng)PI3K/AKT 通路蛋白的磷酸化水平,降低自噬蛋白LC3II/LC3I與Beclin-1表達(dá),表明PI3K/AKT 信號(hào)通路通過介導(dǎo)利多卡因?qū)θ毖?再灌注心律失常的治療過程。為進(jìn)一步證實(shí)相關(guān)猜想,以PI3K/AKT 信號(hào)抑制劑LY294002與利多卡因聯(lián)合干預(yù)缺血-再灌注心律失常大鼠,相比單獨(dú)使用利多卡因,大鼠心肌損傷及心律失常癥狀加劇,表明LY294002可減弱利多卡因的抗炎、抗氧化及抑制過度自噬的作用,拮抗利多卡因?qū)π募p傷的改善功效,逆轉(zhuǎn)其抗心律失常功效,揭示利多卡因可通過激活PI3K/AKT 信號(hào)減輕缺血-再灌注損傷引發(fā)的心律失常。本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證利多卡因的調(diào)控關(guān)系,但PI3K/AKT 信號(hào)通路作用廣泛,受多種因素調(diào)控,是否有其他因子可調(diào)控相關(guān)通路影響疾病還有待進(jìn)一步研究,利多卡因作用廣泛,是否通過其他通路間接參與調(diào)控疾病也有待驗(yàn)證。