王學良, 王忠妮, 李祖軍, 徐海峰, 龔記熠, 浦選昌, 鄭桂云, 張玉珊, 朱速松

(1.貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550001; 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所,貴州貴陽 550006;3.貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)科學院,貴州黔東南 556099; 4.貴州省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所,貴州貴陽 550006)

我國香稻因具有濃郁的香氣,廣受消費者的喜愛。人們目前普遍認為,香稻中主要香味物質(zhì)為 2-乙酰-1-吡咯啉2-AP,2-AP的合成主要是因為Badh2基因突變所導致的[1]。Badh2基因會編碼甜菜堿醛脫氫酶,催化4-氨基丁醛轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酸,由此使得2-AP的合成遭到抑制,導致稻米缺乏香氣。當Badh2基因突變后,甜菜堿醛脫氫酶失去活性,抑制了4-氨基丁醛向4-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化,解除了對2-AP合成的抑制,從而使稻米產(chǎn)生了香味[2]。研究發(fā)現(xiàn)Badh2的突變類型復(fù)雜多樣,在1、2、4、5、7、10、12、13、14外顯子上都有突變位點[3]。最常見的為Badh2.1,即第7外顯子上所發(fā)生的8堿基缺失以及3堿基突變,著名香稻Basmati和Jasmine便是這種等位基因型[4]。然而影響稻米香味的物質(zhì)并不只有2-AP,除2-AP外稻米中100多種物質(zhì)可產(chǎn)生香味,主要包括醛、酮、醇、烴類等[5]。醛類物質(zhì)在稻米揮發(fā)性物質(zhì)中占重要地位,其中壬醛、己醛、庚醛、辛醛對稻米香味影響最大[6]。研究發(fā)現(xiàn),香稻的生長條件也會影響自身的香氣濃度,如光照、溫度、水分、肥料、礦質(zhì)元素、鹽分等因素[7]。徐振江等發(fā)現(xiàn),溫度對稻米香味濃淡有著重要影響,當?shù)久椎纳L溫度大于25 ℃時稻米的香味就會有所下降[8]。Bao等的研究表明,利用干濕交替的方式進行灌溉最終會使稻米有更加濃郁的香氣[9]。鐘群等研究發(fā)現(xiàn),氮肥可以增加稻米中游離脯氨酸,并且可以促進2-AP的積累[10]。孫樹俠等研究發(fā)現(xiàn),在氮元素含量較高的種植地稻米中2-AP含量會更高,香味更濃[11]。Mo等研究發(fā)現(xiàn),施硅肥也可以增加稻米中2-AP的含量[12]。Luo等研究發(fā)現(xiàn),硒肥也可以使稻米中2-AP的含量增加[13]。唐湘如等研究發(fā)現(xiàn),在水稻生長期間,噴灑氯化鑭能顯著提高稻米中2-AP的含量,使稻米香味更濃[14]。

茍當3號是貴州省黔東南州精心培育的特有香稻品種,它香氣怡人,品質(zhì)優(yōu)良。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)種植的茍當3號其稻米香味濃度具有較大差異。為明確茍當3號產(chǎn)生香味以及不同種植點香味濃度差異的原因,本研究分析了茍當3號中Badh2的基因型,并對不同種植點的稻米進行了香味鑒定、揮發(fā)性成分分析,以及土壤成分分析,以期揭示不同地區(qū)種植的茍當3號香味差異形成的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

茍當3號于2021年種植于貴州省從江縣5個不同地區(qū),種植點從高到低依次為高嶺857 m、機英林637 m、芩木535 m、高大437 m、蝦板242 m。材料進行正常田間管理,抽穗后取葉片置于超低溫冰箱中保存,種子成熟后室溫放置3個月,性狀穩(wěn)定后稱取飽滿的稻谷20 g,用綠洲鋒速LTJM160型精米機脫殼,用FS-Ⅱ型實驗室旋風式粉碎磨磨成米粉過50目篩,真空包裝,-20 ℃保存。

1.2 香味感官評價試驗

將5 g葉片打碎倒入試管后加1.7%氫氧化鉀溶液,用橡膠塞堵住管口,常溫浸泡10 min后打開試管逐一嗅其氣味,并對香味濃度進行評定。根據(jù)Golam等的方法[15]對水稻的香氣進行評分。對樣品按5個標準進行評分,其中1、2、3、4、5分別對應(yīng)無香氣、輕度香氣、中度香氣、高度香氣、特濃香氣。所有的樣本都由3名經(jīng)驗豐富的小組成員進行評分。

1.3 茍當3號Badh2基因全長測序

為驗證茍當3號會產(chǎn)生香氣的原因是否為Badh2基因的突變而導致的,對茍當3號的Badh2基因全長進行測序。首先待抽穗后從大田內(nèi)收取材料的葉片組織采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取材料葉片組織DNA。其次在NCBI網(wǎng)站上搜索Badh2基因的全基因組序列,引物參考Shi等在文獻中設(shè)計的10對Badh2基因全長擴增引物[2]。由北京擎科生物科技有限公司合成這10對引物。合成后對茍當3號的DNA進行擴增。其擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電詠檢測合格后送北京擎科生物科技有限公司進行測序,并使用DNAman對測序結(jié)果進行對比分析。

1.4 揮發(fā)性成分分析

將25 g米粉倒進50 mL頂空進樣瓶中,蓋好瓶口,加入40 mL ddH2O后放置于加熱平臺。于80 ℃進行加熱,一定溫度平衡20 min。平衡后將萃取頭刺穿隔墊,調(diào)整高度置于樣品上方5 cm處,萃取吸附40 min后將纖維頭插入氣相色譜-質(zhì)譜儀進口解吸5 min。進樣口溫度255 ℃,流速1.0 mL/min。起始柱溫為45 ℃,以9 ℃/min的速度升溫,溫度達到255 ℃后保持10 min。電離方式EI,質(zhì)譜掃描范圍40～500 amu/s,檢索數(shù)據(jù)庫NIST11。

1.5 土壤檢測方法

pH值采用pH計進行檢測;有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀滴定比色法測定;全氮含量采用凱氏定氮法測定;全鉀含量采用NaOH熔融火焰光度法測定;堿解氮含量采用堿解擴散法測定;速效磷含量采用鉬銻抗比色法測定;速效鉀含量采用NH4AC浸提法測定;全磷含量采用堿溶鉬銻抗比色法測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Thermo TraceFinder 4.1軟件對數(shù)據(jù)進行處理,未知成分經(jīng)過檢索后同標準數(shù)據(jù)庫進行對比。篩選出綜合分大于70同時正反比對分數(shù)大于600的物質(zhì)。將篩選出來的物質(zhì)的保留指數(shù)與NIST library(2017)數(shù)據(jù)庫進行比對來確定其成分。揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量應(yīng)用面積歸一法計算。數(shù)據(jù)處理采用Excel 2021。

2 結(jié)果與分析

2.1 香味感官評價試驗

本研究在從江縣選取5個地區(qū)對茍當3號進行種植。采用KOH浸泡法對5個地區(qū)的稻米香味給予評判。由10人組成小組每人2次對材料進行聞香味試驗并對香味濃度進行打分。通過感官試驗,發(fā)現(xiàn)不同種植點種植的稻米的香味存在差異(表1)。在高嶺種植點稻米的香味最為濃郁,在蝦板種植點香味得分最低。

表1 稻米香味感官評價排列

2.2 茍當3號Badh2基因全長測序結(jié)果

為探究茍當3號產(chǎn)生香味是否為Badh2基因突變所致,對茍當3號中Badh2基因進行測序。序列對比結(jié)果顯示,茍當3號的Badh2基因在第7外顯子表現(xiàn)為3 bp突變以及8 bp缺失(圖1),從而斷定茍當3號會產(chǎn)生香氣是由于Badh2基因的突變所致。

2.3 5個不同種植點稻米揮發(fā)性成分分析

為了探究茍當3號在不同種植點香味差異的原因是否與2-AP含量有關(guān),本試驗對不同種植點茍當3號中香味揮發(fā)物2-AP濃度進行測定。從檢測結(jié)果來看不同種植點茍當3號中2-AP的濃度存在差異(表2)。且隨著種植點海拔的升高稻米中2-AP的含量也隨之增加(圖2)。同時為研究其他揮發(fā)性物質(zhì)對茍當3號香味的影響,本研究對5個種植點稻米中的揮發(fā)性成分進行分析,檢測出的揮發(fā)性成分主要包括醛類(壬醛、己醛、庚醛、辛醛、戊醛、苯甲醛等)、醇類(1-鋅烯醛-3-醇、正己醇等)、酮類(3-己酮、2,3-丁二酮等)(表3)。通過檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種植點其稻米中的揮發(fā)性物質(zhì)存在較大差異。在高嶺種植點稻米香味最為濃郁,而蝦板種植點香味最低,在高嶺種植點稻米中2-AP與壬醛的含量都高于蝦板種植點,且這2種物質(zhì)的濃度都隨著種植點的升高而增加。2-AP與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果(表4)表明,2-AP與壬醛呈極顯著正相關(guān),與異丁醛則不相關(guān)。造成二者間香味濃度差距的主要原因可能是由于稻米中2-AP與壬醛含量的差異。

表2 不同種植點稻米2-AP濃度

表3 茍當3號材料不同海拔高度種植地點各類揮發(fā)物質(zhì)種類及其含量的GC-MS分析結(jié)果

表4 2-AP與揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4 不同種植點的土壤特性

為明確茍當3號的香氣濃度與土壤成分的關(guān)系,本研究對5個種植點土壤的堿解氮含量、速效鉀含量、有效磷含量、全磷含量、全鉀含量、全氮含量、有機質(zhì)含量及pH值共8個指標進行測定。檢測結(jié)果(表5)顯示以上8個指標在從江縣5個種植點中分布具有較大差異,堿解氮含量在機英林種植點最高,為287.67 mg/kg;有機質(zhì)含量在高嶺種植點最高,為52.43 g/kg;pH值在高嶺種植點最高,為5.37;全鉀、速效鉀含量在芩木種植點最高,分別為14.36 g/kg、47.06 mg/kg;全磷、有效磷含量在高大種植點最高,分別為1.11 g/kg、30.17 mg/kg;全氮含量最高的種植點為高嶺,為3.02 g/kg。對比5個地區(qū)的土壤成分可以發(fā)現(xiàn),堿解氮與有效磷含量的變異系數(shù)達到了94.00%,說明這2種成分在不同的土壤中差別較大,變異系數(shù)最小的為pH值,說明在不同種植地土壤中變化較小。速效鉀、全磷、全鉀、全氮、有機質(zhì)含量的變異系數(shù)范圍在19%～55%之間,說明這5個指標在不同種植點土壤中具有較大差別。通過對比蝦板與高嶺種植點的土壤成分發(fā)現(xiàn),在高嶺種植點土壤中,除有效磷、全鉀含量外,其他指標均高于蝦板種植點,全氮與有機質(zhì)的含量更是明顯高于蝦板地區(qū)且遠高于5個種植點的平均值。

表5 從江縣不同種植點土壤肥力成分含量

為了研究土壤成分對香味揮發(fā)性物質(zhì)的影響,對土壤成分與香味揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)性進行分析。結(jié)果表明,土壤中全氮含量與2-AP、壬醛、庚醛呈顯著正相關(guān),有機質(zhì)含量與2-AP、壬醛、辛醛呈顯著正相關(guān),pH值與正己醇呈顯著正相關(guān),全鉀含量與己醛、戊醛、異丁醛、2-甲基丁醛呈顯著正相關(guān),全磷含量與糠醛呈顯著正相關(guān),有效磷含量與糠醛呈顯著正相關(guān),全鉀含量與糠醛呈顯著負相關(guān),有效磷含量與異丁醛呈顯著負相關(guān)(表6)。

表6 土壤養(yǎng)分與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

稻米能否產(chǎn)生香味通常取決于其體內(nèi)的Badh2基因是否發(fā)生突變[16]。Badh2基因的突變類型有很多,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)17個突變類型,最常見的為在第7外顯子所發(fā)生的8堿基缺失以及3堿基替換,從而造成2-AP的積累[17]。 通過對茍當3號的Badh2基因組進行全長測序基本證實了茍當3號之所以會產(chǎn)生香味是由于其Badh2基因第7外顯子發(fā)生突變導致2-AP積累引起的。

除受基因影響外,生長環(huán)境也對稻米的香味起重要作用,其中土壤環(huán)境最為關(guān)鍵,土壤中的全氮、有機質(zhì)含量在很大程度上影響著稻米的香味[18]。在全氮含量高的地區(qū)同一品種的稻米通常會比其他種植點的稻米更具有香氣[19-20]。氮肥能夠提高植株體內(nèi)的氮含量,利于促進氨基酸的合成,氨基酸是2-AP合成的重要組分,因此增加氮肥有利于提高稻米中2-AP的含量[21-22]。海拔高度會影響環(huán)境的溫度、光照等條件從而影響稻米香味的濃度[23]。對不同地區(qū)茍當3號2-AP含量進行檢測,發(fā)現(xiàn)2-AP濃度會隨著種植點的升高而隨之增高同時稻米的香味也會增加,說明海拔高度對2-AP濃度具有一定的影響。土壤養(yǎng)分與稻米揮發(fā)性物質(zhì)含量相關(guān)性分析結(jié)果表明,土壤中全氮、有機質(zhì)含量與2-AP濃度呈顯著正相關(guān),當土壤中全氮、有機質(zhì)含量升高時2-AP的濃度也會隨之升高,并且稻米的香味也會增加。在高嶺種植點土壤中全氮含量較高,進而促進了2-AP的合成,使該地點的稻米香味更加濃郁,該結(jié)果與佟天一等所研究的氮肥對香稻影響的結(jié)果[24]基本吻合。同時通過土壤養(yǎng)分與稻米中揮發(fā)性物質(zhì)含量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),全氮含量與4-氨基丁醛呈顯著正相關(guān)而與γ-氨丁基酸相關(guān)性不顯著。4-氨基丁醛為2-AP合成的前體物質(zhì)而γ-氨丁基酸是Badh2基因正常無突變的情況下由4-氨基丁醛轉(zhuǎn)化而來,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn) 4-氨基丁醛含量的上升并未導致γ-氨丁基酸含量的增加,表明茍當3號會產(chǎn)生香味的原因是Badh2基因發(fā)生了突變。

香稻中揮發(fā)性成分復(fù)雜多樣,可達200多種,其中具有香氣的近100種,主要為醛類、醇類、酯類、酮類、烴類以及酚類[25-26]。在茍當3號稻米中所測出的揮發(fā)性物質(zhì)共有16種,其中醛類物質(zhì)最多,且醛類物質(zhì)中戊醛、庚醛、己醛、壬醛含量較為突出,這些物質(zhì)對稻米的香味都具有重要影響。醛類物質(zhì)閾值很低且對稻米香味有重要影響[27-28]。在檢測到的揮發(fā)性成分中我們發(fā)現(xiàn)了一個重要的化合物——壬醛。該物質(zhì)與2-AP具有十分相似的氣味,并且在稻米中的含量也是隨著種植點海拔的升高而逐漸增高。土壤養(yǎng)分與稻米揮發(fā)性物質(zhì)含量相關(guān)性分析結(jié)果表明,壬醛與全氮、有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。2-AP濃度與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果表明,2-AP濃度與4-氨基丁醛、壬醛含量呈極顯著正相關(guān)。4-氨基丁醛為合成2-AP的前體物質(zhì),與2-AP濃度呈正相關(guān),壬醛與2-AP有著相似的氣味并且與全氮、有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān),因此影響稻米茍當3號香味的另一因素就是稻米中壬醛的含量。

本研究對茍當3號的Badh2基因進行全基因組測序發(fā)現(xiàn)在第7外顯子處發(fā)生了3 bp突變以及 8 bp 缺失,該突變會造成2-AP的積累。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),稻米中壬醛的含量也對稻米的香氣有一定的影響,因此造成茍當3號香味差異的主要成分是稻米中2-AP與壬醛的含量。同時結(jié)合土壤基本養(yǎng)分與香味揮發(fā)性物質(zhì)含量的分析來看,稻米香味主要受土壤中全氮、有機質(zhì)含量的影響,因此可以通過改善土壤中有機質(zhì)、全氮的含量從而進一步提高茍當3號的香味濃度。