肖婉鈺, 王 盼, 孫藝嘉, 周賢玉, 任海龍, 鄒集文, 張 晶, 黃江華, 許東林

(1.廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,廣東廣州 510000; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,廣東廣州 510000)

玉米是我國(guó)種植面積廣泛的重要糧食作物之一,為了確保在玉米種植業(yè)中使用優(yōu)良種子,實(shí)現(xiàn)優(yōu)產(chǎn)、高產(chǎn),用種前需要對(duì)玉米種子進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。發(fā)芽率是反映種子質(zhì)量的1個(gè)關(guān)鍵指標(biāo),在種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)工作中是必檢項(xiàng)目。根據(jù)GB/T 3543.4—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)》,農(nóng)作物種子發(fā)芽率的測(cè)定歷時(shí)7～21 d(玉米為 8 d),在此過(guò)程中,常見(jiàn)受檢種子和/或幼苗因本身攜帶各類病原菌[1]或受到環(huán)境中微生物污染而出現(xiàn)發(fā)霉、腐爛的現(xiàn)象,可能對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響,需要重新測(cè)定。分析玉米種子樣品萌芽過(guò)程中可能出現(xiàn)的污染性微生物種類,對(duì)于在測(cè)定發(fā)芽率前對(duì)種子樣品進(jìn)行適宜的預(yù)處理(如消毒、滅菌等)、提高種子質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和工作效率、篩選健康種子、預(yù)先避免玉米種傳病害的發(fā)生等均具有參考價(jià)值。本研究挑選廣東地區(qū)種子質(zhì)量監(jiān)督工作中抽檢的8份玉米種子樣品,采用微生物培養(yǎng)與高通量測(cè)序分析等方法對(duì)其在發(fā)芽率測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生的污染性微生物種類進(jìn)行鑒定,以期為玉米種子質(zhì)量控制及種傳病害預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子樣品

供試的8份玉米種子來(lái)自2021年廣東省種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中的抽檢樣品,其編號(hào)分別為ym1(華美甜9號(hào))、ym2(華美糯7號(hào))、ym3(耕耘白糯)、ym4(華旺甜7號(hào))、ym5(正大999)、ym6(極峰30)、ym7(桂單166)、ym8(華美甜168)。上述種子樣品均來(lái)自廣州市轄區(qū)內(nèi),系市售的小包裝商品(每包500 g或1 000 g),包裝完好,種子無(wú)包衣,開(kāi)始本試驗(yàn)時(shí)保質(zhì)期限均大于6個(gè)月,抽樣后于20 ℃干燥保存。

1.2 種子萌芽及污染性微生物樣品的采集

在2021年5月,按照GB/T 3543—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》中的要求,在廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室中對(duì)上述ym1～ym8種子樣品進(jìn)行凈種子分離和發(fā)芽率試驗(yàn)。每份樣品隨機(jī)選取400粒凈種子(100?！?個(gè)重復(fù)),夾在2層濕潤(rùn)的發(fā)芽紙之間,隨后將其放入發(fā)芽盒中(每盒1個(gè)重復(fù)),在光照培養(yǎng)箱(25 ℃,光—暗周期為12 h—12 h)內(nèi)保濕培養(yǎng)8 d后,參照GB/T 3543.4—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)》中的方法測(cè)定發(fā)芽率(正常幼苗數(shù)/置床種子總數(shù)×100%),并統(tǒng)計(jì)污染率(出現(xiàn)發(fā)霉?fàn)钗廴疚锏姆N子數(shù)或幼苗數(shù)/置床種子總數(shù)×100%)。萌芽結(jié)束后,在生物安全柜中用滅菌的金屬樣品勺將發(fā)芽盒中的幼苗根部和/或發(fā)芽紙上出現(xiàn)的發(fā)霉樣污染物刮下,將每份種子樣品(4個(gè)發(fā)芽盒)中的污染物合并溶解于20 mL滅菌雙蒸水中,所得溶液保存于 -20 ℃ 備用。在本研究中,將ym1～ym8在萌芽過(guò)程中產(chǎn)生的污染性微生物命名為樣品YM1～YM8。

1.3 污染性微生物種類的鑒定

將染污物樣品YM1～YM8經(jīng)干冰運(yùn)輸交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行總DNA提取、PCR 擴(kuò)增與高通量測(cè)序。用FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒(美國(guó)MP Biomedicals)對(duì)污染性微生物菌液進(jìn)行總DNA的提取,并用NanoDrop 2000分光光度計(jì)進(jìn)行純度與濃度檢測(cè)。以所得總DNA為模板,采用真菌ITS1區(qū)通用引物5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′與 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′對(duì)樣品中所含的真菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增,采用細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)通用引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′與5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′(H=A/C/T,V=A/C/G,W=A/T)對(duì)樣品中所含的細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增。所得擴(kuò)增產(chǎn)物按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建并通過(guò)Illumina Miseq/Hiseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序完成后,對(duì)所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭及引物序列、paired-end序列拼接等處理,再用barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分各樣品的測(cè)序結(jié)果,最后對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾,得到各樣品的有效測(cè)序數(shù)據(jù)。用Usearch v11軟件(http://drive5.com/usearch/manual/)剔除重復(fù)序列,按照相似性≥97%的非重復(fù)序列為1個(gè)out(operationaltaxonomic units),對(duì)所有非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU 聚類,獲得各個(gè)OTU的代表序列。通過(guò)GenBank BLAST比對(duì),按相似度>90%且coverage>90%的標(biāo)準(zhǔn)篩選用于后續(xù)分類的OTU序列(不滿足該條件的序列被歸為“unclassified”),再用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列,進(jìn)行分類學(xué)分析,鑒別每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息。細(xì)菌16S rDNA片段采用RDP classifier比對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫(kù),真菌ITS片段序列使用BLAST比對(duì)UNITE數(shù)據(jù)庫(kù),最終分別在門(mén)(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)等分類階元上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。用Mothur軟件計(jì)算各樣品中微生物群體的豐富度指數(shù)(Chao1與ACE)、多樣性指數(shù)(Shannon與Simpson)及測(cè)序文庫(kù)覆蓋率(coverage)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子樣品的發(fā)芽率及污染情況

置床培養(yǎng)8 d后,樣品ym1～ym8的發(fā)芽率為80%～92%,其中2個(gè)樣品(ym1=80%,ym2=82%)的發(fā)芽率低于GB 4401.1—1996《糧食作物種子——禾谷類》中規(guī)定的國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(85%),但在使用容許誤差(5%)內(nèi)可判定為合格。8個(gè)樣品的發(fā)霉率為4%～15%,其中ym1、ym2、ym4的污染率均大于10%,表現(xiàn)為死種子或腐爛幼苗。此結(jié)果表明,污染性微生物可對(duì)部分種子樣品的發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大影響,甚至有可能影響合格性判定的準(zhǔn)確性。

2.2 污染性細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列優(yōu)化和OTU聚類,分別從8份玉米種子萌芽過(guò)程中產(chǎn)生的污染性微生物樣品(YM1～YM8)中獲得41 467～61 104條細(xì)菌DNA序列,共計(jì)68～231個(gè)OTU,8個(gè)樣品共獲得268個(gè)不同的細(xì)菌OTU。用RDP classifier對(duì)這些OTU進(jìn)行分類學(xué)分析,結(jié)果表明,8個(gè)樣品中所含有的分類地位明確的細(xì)菌共來(lái)自11門(mén)、22綱、36目、62科、119屬(表1)。其中,來(lái)自YM3和YM4的OTU數(shù)量及鑒定出的各級(jí)分類階元數(shù)量均顯著少于其他6個(gè)樣品。根據(jù)Shannon指數(shù)的計(jì)算結(jié)果,YM2的細(xì)菌群體多樣性最高,YM8的多樣性最低,二者均與其他6個(gè)樣品間有較大差異;根據(jù)Chao1及ACE指數(shù)的計(jì)算結(jié)果,YM2的細(xì)菌群落豐富度最高,YM1次之,YM3和YM4的群落豐富度最低(表1)。整體上看,樣品的細(xì)菌群落豐富度越高,其包含不同分類階元的數(shù)量越多。

表1 玉米發(fā)芽率測(cè)定過(guò)程中污染性微生物群落的多樣性

在門(mén)水平上,各樣品的平均相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有3個(gè)門(mén),分別是變形菌門(mén)占比為76.8%,擬桿菌門(mén)占比為21.3%,厚壁菌門(mén)占比為1.2%,其中在YM3、YM5中變形菌門(mén)相對(duì)豐度高達(dá)97.9%～98.7%,在YM6中,擬桿菌門(mén)占53.6%,變形菌門(mén)占45.6%。此外,裝甲菌門(mén)(Armatimonadetes)細(xì)菌僅在YM2中檢測(cè)到,相對(duì)豐度為3.5%,這部分細(xì)菌屬于菌毛單胞菌綱、菌毛單胞菌目(Fimbriimonadales)、菌毛單胞菌科(Fimbriimonadaceae)、菌毛單胞菌屬(Fimbriimonas)。在綱水平上,從8個(gè)樣品中共鑒定到8個(gè)相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌綱,其中6個(gè)樣品中大部分(57%～88%)細(xì)菌來(lái)自γ-變形菌綱,而YM2、YM6中的細(xì)菌分散于不同的綱(表2)。

表2 玉米發(fā)芽率測(cè)定過(guò)程中的污染性微生物綱水平的組成及相對(duì)豐度

從8個(gè)污染物樣品中共鑒定到相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有12目、19科,它們?cè)诟鳂悠分械南鄬?duì)豐度見(jiàn)圖1?？梢钥闯?在目水平上,假單胞菌目(Pseudomonadales)在4個(gè)樣品中為優(yōu)勢(shì)類群(占36.2%～79.7%),腸桿菌目(Enterobacteriales)在2個(gè)樣品中為優(yōu)勢(shì)類群(相對(duì)豐度>55%),黃桿菌目(Flavobacteriales)在1個(gè)樣品中為優(yōu)勢(shì)類群(占35.3%);而YM2中的細(xì)菌較分散,其中有87%來(lái)自伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、腸桿菌目、噬纖維菌目(Cytophagales)、假單胞菌目、黃桿菌目、根瘤菌目(Rhizobiales)等8個(gè)目(占6.7%～17.1%)(圖1)。在科水平上,在不同樣品中占比>35%的優(yōu)勢(shì)類群有假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)等(圖1)。

由圖2可以看出,在屬水平上,假單胞菌屬(Pseudomonas)在3個(gè)樣品(YM1、YM4、YM8)中為優(yōu)勢(shì)類群,占36%～77%;泛菌屬(Pantoea,占52.4%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium,占35.0%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter,占52.5%)分別為YM5、YM6、YM7中的優(yōu)勢(shì)類群。此外,鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、Luteibacter等屬在部分樣品中含量較高(8%～18%)。上述10個(gè)屬在8個(gè)樣品中的平均相對(duì)豐度為1%～24%。

2.3 污染性真菌的群落結(jié)構(gòu)

基于測(cè)序結(jié)果的OTU聚類結(jié)果顯示,8個(gè)玉米種子污染物樣品(YM1～YM8)獲得了15 844～63 383 條真菌DNA序列,共計(jì)33～92個(gè)OTU,8個(gè)樣品共獲得115個(gè)不同的真菌OTU。采用RDP classifier對(duì)這些OTU進(jìn)行分類學(xué)分析, 結(jié)果(表1)表明,8個(gè)樣品中含有的分類地位明確的真菌共來(lái)自3門(mén)、16綱、27目、53科、71屬、93種。根據(jù)Shannon指數(shù)的計(jì)算結(jié)果,YM5真菌群體的多樣性最高,YM2的多樣性最低。根據(jù)Chao1、ACE指數(shù)的計(jì)算結(jié)果,YM4的細(xì)菌群落豐富度最高,YM6次之,YM5的細(xì)菌群落豐富度最低。

在門(mén)水平上,從8個(gè)樣品中共鑒定到3個(gè)真菌門(mén):子囊菌門(mén)(Ascomycota)、毛霉菌門(mén)(Mucoromycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota),平均相對(duì)豐度分別為57.67%、41.59%、0.67%。子囊菌門(mén)在其中5個(gè)樣品(YM1、YM3、YM5、YM7、YM8)中的相對(duì)豐度高達(dá)69.5%～99.7%,而毛霉菌門(mén)(占58.6%～98.0%)在另外3個(gè)樣品中為優(yōu)勢(shì)類群,擔(dān)子菌門(mén)在YM5中占4.4%,在其余7個(gè)樣品中的含量均不足0.3%。在綱水平上,從8個(gè)樣品中共鑒定到8個(gè)相對(duì)豐度>1%的真菌綱,其中糞殼菌綱(Sordariomycetes,占56.4%～93.2%)在YM1、YM3、YM8中為優(yōu)勢(shì)類群,毛霉菌綱(Mucoromycetes,占58.6%～98.0%)為YM2、YM4、YM6中的優(yōu)勢(shì)類群,散囊菌綱(Eurotiomycetes)在YM7中的相對(duì)豐度高達(dá)93.4%,而YM5中的真菌分散于不同的綱中(表2)。在目、科水平上,毛霉目(Mucorales)及其下屬的根霉科(Rhizopodaceae)在樣品YM2與YM6中,肉座菌目(Hypocreales)及其下屬的肉座菌科(Hypocreaceae)在YM8中為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群(相對(duì)豐度為92%～98%),根霉科在YM4中為優(yōu)勢(shì)類群(占58.6%);散囊菌目(Eurotiales)在YM7中占93.3%,由其下屬的曲霉科(Aspergillaceae,占55.2%)、毛刷囊菌科(Trichocomaceae,占38.1%)組成;在其余4個(gè)樣品中,也是上述3個(gè)目的豐度最高(圖3)。此外,叢赤殼科(Nectriaceae)在樣品YM1、YM3中為優(yōu)勢(shì)類群,占56%～60%。

在屬水平上,根霉屬(Rhizopus)、赤霉屬(Gibberella)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、籃狀菌屬(Talaromyces)在8個(gè)樣品中的平均相對(duì)豐度(6%～41%)排前5名,它們是部分樣品中的優(yōu)勢(shì)類群(圖4)。其中根霉屬及其下屬種少根根霉(R.arrhizus)在YM2中相對(duì)豐度均為98%,在YM6中的相對(duì)豐度均為95%;木霉屬在YM8中占92%,其下屬種棘孢木霉(T.asperellum)在該樣品中的相對(duì)豐度為89%;赤霉屬及其下屬種藤倉(cāng)赤霉(G.fujikuroi)在YM1中均占59%,在YM3中均占56%;青霉屬、籃狀菌屬在YM7中分別占46%、38%,其下屬種草酸青霉(P.oxalicum,相對(duì)豐度45%)、當(dāng)歸籃狀菌(T.angelicus,相對(duì)豐度37%)在該樣品中是這2個(gè)屬的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)8份市售玉米種子樣品在發(fā)芽率測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生的污染性真菌與細(xì)菌群體進(jìn)行了分子鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了來(lái)自11門(mén)、119屬的細(xì)菌,以及來(lái)自3門(mén)、71屬的93種真菌,表明玉米種子上的污染性微生物具有豐富的多樣性。玉米種子的帶菌性有多種鑒定方法[1],前人多將種子洗滌液涂布于培養(yǎng)基(如PDA、LB等固體培養(yǎng)基)上或?qū)⒎N子置于培養(yǎng)基上進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)[2-4],亦有采用PCR或免疫學(xué)方法進(jìn)行玉米病原菌檢測(cè)的報(bào)道[5-7]。但是培養(yǎng)基未必適合所有種類的微生物生長(zhǎng),且不同微生物之間可能存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)或相互拮抗,群體中相對(duì)含量較低的微生物種類難以獲得培養(yǎng),PCR及免疫學(xué)檢測(cè)只能鑒定特定的微生物種類。本研究采用對(duì)玉米種子和/或幼苗周圍產(chǎn)生的發(fā)霉?fàn)钗廴疚镞M(jìn)行高通量測(cè)序的方法,可對(duì)玉米種子攜帶的微生物種類“能檢盡檢”,充分揭示其群體的多樣性,尤其是關(guān)于玉米種子攜帶細(xì)菌的多樣性研究甚少,本研究結(jié)果豐富了此方面的知識(shí)。此外,本研究共鑒定了玉米種子在長(zhǎng)達(dá)8 d(經(jīng)過(guò)種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)初期)的發(fā)芽率測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生的污染性微生物,較之僅鑒定種子初始(萌發(fā)前)攜帶的微生物種類的研究,對(duì)于探明影響玉米種子發(fā)芽率結(jié)果的因素,為種子檢驗(yàn)制訂質(zhì)控措施更具有參考意義。本研究結(jié)果表明,微生物污染可能會(huì)影響玉米種子發(fā)芽率的合格性判定。在測(cè)定試驗(yàn)之前應(yīng)先對(duì)種子進(jìn)行消毒處理(如用次氯酸鈉處理、加熱處理[8]),至于不同的消毒措施能殺滅哪些污染性微生物,對(duì)發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果有何影響,乃至是否應(yīng)把消毒后再進(jìn)行測(cè)定所得的結(jié)果視為更準(zhǔn)確的結(jié)果,這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步研究。

本研究從玉米種子污染物中鑒定到假單胞菌屬、泛菌屬、金黃桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬等細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群。其中假單胞屬中的茄青枯假單胞菌(P.solanacearum)、丁香假單孢菌(P.syringae)是常見(jiàn)的植物病原細(xì)菌[9-11],后者可侵染玉米等禾谷類作物[12],且有報(bào)道表明,P.lapsa、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)等可引致玉米細(xì)菌性莖腐病[12-13];另一方面,熒光假單胞菌(P.fluroscens)是可拮抗多種植物病害的生防菌[14-15]。泛菌屬中的成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)可侵染人類及動(dòng)植物[16],國(guó)內(nèi)有報(bào)道稱,該菌可引致玉米細(xì)菌性干莖腐病且可經(jīng)種子傳播[17],而該屬的另一個(gè)種斯氏泛菌(Pantoeastewartii)為另一種種傳病害玉米細(xì)菌性枯萎病的病原[18]。由于根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列難以準(zhǔn)確鑒定到種,尚不明確本研究中種子攜帶的假單胞菌與泛菌是否為玉米病原菌,但對(duì)種子進(jìn)行消毒處理可以防止?jié)撛谟衩撞『Φ膫鞑ァＳ醒芯堪l(fā)現(xiàn),金黃桿菌屬是玉米根系微生物組的模式細(xì)菌群落之一,具有抑制玉米苗枯病的生防效果[19],不動(dòng)桿菌屬亦是植物病害的拮抗菌,可來(lái)自土壤或植物根組織內(nèi)部[20-21]。

本研究從玉米種子污染物中鑒定到的優(yōu)勢(shì)真菌類群可由5個(gè)種代表。其中少根根霉又稱稻根霉(R.oryzea)是一種在食品、藥品及化工等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛的真菌[22],亦可引致多種作物病害,是玉米根腐病的病原之一[23-24];藤倉(cāng)赤霉是水稻及玉米惡苗病、甘蔗梢腐病等多種作物病害的病原[25];棘孢木霉是一種生防菌,對(duì)植物病原物有拮抗作用[26-28];草酸青霉可拮抗馬鈴薯霜霉菌、蘋(píng)果鐮孢菌等[29-30];籃狀菌屬是環(huán)境中廣泛存在的腐生霉菌,該屬中不同的種或?yàn)槿?、?dòng)物的條件致病菌,或?yàn)槭称饭I(yè)中的污染物,部分種分布于植物葉際,可作于生物防治多種土壤植物病原真菌[31],但是目前關(guān)于當(dāng)歸籃狀菌的生物功能未見(jiàn)報(bào)道。其他常見(jiàn)的種子攜帶玉米病原真菌屬如曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)等[1,3-4]在本研究中亦有檢出,但含量很低。本研究鑒定到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與真菌類群中既有植物病原菌也有生防菌,研究它們?cè)谔镩g生境中的共存與互作,將有助于深入了解相關(guān)植物病害的流行規(guī)律,為病害防治提供有益線索。