劉菲,王文翠,徐悅,姚雷,韓婷婷,楊素珍
(1.山東福瑞達生物股份有限公司,山東 濟南 250101;2.新疆伊帕爾汗香料股份有限公司,新疆 伊犁 835213;3.上海交通大學,上海 200240)
薰衣草精油(lavender oil)在中國主要產(chǎn)自新疆的伊犁,是當?shù)靥厣?jīng)濟作物薰衣草主要的加工產(chǎn)品,由于目前國內對薰衣草精油的加工利用較少,主要以出口為主,價格由國外市場所決定,種植的農(nóng)民收益較低。如何提高薰衣草精油的開發(fā)利用價值,已成為保護我國特色經(jīng)濟作物在國際上占有地位亟待解決的問題。已有大量的研究表明,薰衣草精油具有一定的助眠作用。目前對失眠的干預主要采用藥理干預和非藥物干預[1],而其中就有一些是采用精油來作為干預辦法,于佳慧等[2]研究了復方寧神精油對失眠大鼠行為學及下丘腦GABA、GLU 含量的影響,結果表明該精油的高濃度組能明顯縮短失眠大鼠睡眠潛伏期并延長睡眠持續(xù)時間,有效緩解失眠所致的緊張焦慮情緒;彭鐘秀等[3]研究了2 種精油成分緩解大學生失眠與焦慮的效果,結果表明精油干預后,延長了總睡眠時間;羅坤垛[4]就中國苦水玫瑰的助眠功效進行了研究,苦水玫瑰精油顯著提高了小鼠下丘腦、海馬、紋狀體的5-HT 等。Cooksley 等[5]綜述了吸入薰衣草精油幫助睡眠的研究,其中吸入2%的薰衣草精油后對焦慮水平和睡眠質量都有所改善。但是,通過喜好度評估試驗發(fā)現(xiàn),大概有30%~40%的人不喜歡薰衣草精油的氣味,這也就意味著薰衣草精油對這部分群體很難發(fā)揮助眠作用。
研究還發(fā)現(xiàn),患有焦慮及相關障礙的人通常睡眠質量差,并表現(xiàn)出睡眠障礙,尤其是失眠[6]。而睡眠障礙又是焦慮及相關障礙的一個核心特征,說明不良睡眠和焦慮會引發(fā)惡性循環(huán)[1]。同時失眠重則會引起一系列疾病,如高血壓、肥胖、糖尿病、腎病等,輕則影響日常工作與學習[7-10]。為了不降低白天的工作質量,大部分人選擇用咖啡來提振精神和增強行為能力,咖啡中含有大量的咖啡因,咖啡因已經(jīng)被證明確實可以改善睡眠不足后的神經(jīng)行為功能,且效果≥21 h[11-13]。但是,很多人在攝入咖啡因以后,又會導致一系列的睡眠問題,包括總睡眠時間減少、入睡困難、夜間覺醒增加、白天嗜睡等[14-17]。而這些與睡眠相關的問題可能在失眠癥患者中被放大[18]?;诖?,本研究將焦慮與咖啡因2 個因素結合起來制造小鼠失眠模型,以探究該模型下精油的作用效果。
綜上,針對上述試驗模型,結合精油在失眠研究中表現(xiàn)出的優(yōu)越效果,探究調配后以薰衣草為主的復方精油在焦慮和咖啡因協(xié)同導致失眠中的作用效果及對相關神經(jīng)遞質的影響,本研究調配了2 種相較于單一薰衣草精油接受度更高的復方精油用于試驗,以期能擴大薰衣草精油的產(chǎn)品加工范圍,增加其商業(yè)價值。
健康BALB/c 小鼠,雌性,6~8 周齡,體質量18~22 g,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠分籠飼養(yǎng)于上海交通大學實驗動物中心,每籠6 只,實行自由攝食和飲水,24 h 給予適宜照明,環(huán)境溫度控制在(25±1)℃,相對濕度保持在(60±10)%,在進行正式試驗前,所有小鼠均適應性飼養(yǎng)1 周。試驗經(jīng)上海交通大學實驗動物機構倫理委員會批準,批準號為A2021019。
2 種精油EO1&EO2(上海交通大學芳香植物研發(fā)中心提供);咖啡因(上海純優(yōu)生物科技有限公司提供);地西泮注射液(上海精神衛(wèi)生中心提供);戊巴比妥鈉(蘇州坤宸生物提供);PBS (0.01M,pH 值7.2-7.4)、無菌生理鹽水(上海泰坦科技股份有限公司提供);小鼠皮質酮(Cortisol)ELISA 試劑盒、小鼠γ 氨基丁酸(GABA)ELISA 試劑盒、小鼠乙酰膽堿(ACH)ELISA 試劑盒、小鼠組胺(HIS)ELISA 試劑盒、小鼠去甲腎上腺素(NE)ELISA 試劑盒、小鼠多巴胺(DA)ELISA 試劑盒(均由上海酶聯(lián)生物提供)。
7890B-5977A 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司);EPM 高架十字迷宮(上海欣軟信息科技有限公司);Sigma 3K15 離心機(德國Sigma Laborzentrifugen 公司);Multiskan Go 酶標儀(上海賽默飛儀器有限公司);XM-650T 超聲波細胞破碎儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司);50 cm×50 cm×25 cm 動物香薰室(上海交通大學芳香植物研發(fā)中心自制);CS-08 三檔香薰機(杭州格林愛有限公司)。
1.4.1 小鼠模型構建 動物分組:將適應飼養(yǎng)1 周后的小鼠隨機分為5 組(n=5×6),即正常對照組CK、模型組、DZP 組(地西泮組)、EO1 組(復方精油1 組)、EO2 組(復方精油2 組)。建模(以睡眠試驗的相關指標與CK 組進行比較,出現(xiàn)差異后,視為造模有效):采用空瓶刺激[19]和咖啡因注射相結合的方法。除CK 組正常飼養(yǎng)不做任何處理外,其余組小鼠實施單只分籠飼養(yǎng),并在前7 d 的2 個固定時間(每天9:00—9:10 和21:00—21:10)進行飲水訓練。飲水訓練后,開始空瓶刺激,采用隨機數(shù)表法,在原來固定供水時間中,一個提供有水的瓶子,另一個只有空瓶,持續(xù)刺激12 d。在空瓶刺激的最后2 d,將咖啡因用生理鹽水溶解(2 mg·mL-1),并于上午9:30—10:30按10 mg·kg-1的劑量進行腹腔注射。在整個模型建立過程中,動物可以自由獲取食物。
1.4.2 精油及藥物干預 在最后1 次注射咖啡因后,將2 種復方精油用荷荷巴油稀釋成3%的濃度,并置于香薰機放在動物香薰室中央隔層中,開二檔進行擴香,將EO1 組和EO2 組分別放置在對應香薰室內,嗅聞30 min;將香薰機中的精油置換成荷荷巴油后,模型組也在香薰室中嗅聞30 min;將地西泮用生理鹽水配制成0.2 mg·mL-1的溶液,并以1 mg·kg-1劑量為DZP 組進行腹腔注射。
1.4.3 高架十字迷宮測試 進行3 次高架十字迷宮測試,第1 次在空瓶刺激的第10 天,參與組為CK組和模型組-空瓶刺激;第2 次在空瓶刺激第11天,并注射咖啡因30 min 后,參與組為模型組-空瓶+咖啡因;第3 次在嗅聞精油/地西泮注射后,參與組為DZP 組、EO1 組和EO2 組。將小鼠置于中央?yún)^(qū)域,頭朝向一側的開放臂放入,開始測試并保持環(huán)境安靜,記錄小鼠5 min 內的行動軌跡,包括小鼠在開放臂(Open arms)和閉合臂(Closed arms)上的進入次數(shù)(OE&CE)和停留時間(OT&CT),以及運動總路程。因小鼠還是有一定的個體差異,同時記錄了小鼠進入開放壁的比列,即進入率。小鼠的焦慮程度與進入各臂的次數(shù)與時間相關,焦慮程度越低,進入開放臂的次數(shù)和停留時間越多[20]。
1.4.4 戊巴比妥誘導睡眠測試 第3 次高架十字迷宮測試結束后,以40 mg·kg-1的劑量給各組小鼠進行戊巴比妥鈉腹腔注射,并觀察,以小鼠翻正反射消失10 s 為入睡信號。從藥物注射到翻正反射消失的時間為睡眠潛伏期,從翻正反射消失到恢復的時間為睡眠持續(xù)時間,即睡眠期。同時記錄在這個過程中每組進入睡眠期的小鼠數(shù)量,即入睡率:
入睡率=入睡小鼠數(shù)/組內小鼠總數(shù)×100% (4)
1.4.5 小鼠血清和腦組織中神經(jīng)遞質和神經(jīng)調節(jié)劑含量檢測 睡眠測試結束后,摘取小鼠眼球,通過眼眶取血0.5 mL,并置于離心機中,在3 000 r·min-1、4 ℃下,離心10 min,取其上清液,采用小鼠皮質酮(Cortisol)ELISA 試劑盒,檢測上清液中皮質酮的含量。取血后,處死小鼠,并立即取腦,分離出下丘腦、垂體,置于1.5 mL 凍存管中,保存在液氮中待用。凍存的組織于室溫平衡2 h 以上,然后用生理鹽水沖洗干凈,再用濾紙把周圍的水分吸干,稱質量;按1∶9質量/體積比(相當于1 g 組織加9 mL 的勻漿液)加入PBS,使用超聲細胞破碎儀在冰浴中充分勻漿;組織勻漿后,在2~8 ℃下以3 000 r·min-1離心15 min,收集上清液。采用酶聯(lián)免疫法,檢測下丘腦和垂體中GABA、DA、NE、ACH 和HIS 物質的含量。這些神經(jīng)遞質和神經(jīng)調節(jié)劑調節(jié)著睡眠和情緒。
1.4.6 2 種精油成分測定 樣品準備:用乙醇-正己烷混合溶液(1∶1,v/v)稀釋精油,稀釋倍數(shù)100 倍,進樣量1 uL。
色譜條件:色譜柱DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm);載氣氦氣(99.999%);載氣流速1 mL·min-1;分流比30∶1;進樣口溫度260 ℃,升溫程序:柱溫50 ℃維持3 min,隨后以4°C·min-1升至120 ℃,維持10 min,再以2°C·min-1升至220 ℃,維持2 min。
質譜條件:離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃;EI+,70 eV;掃描方式為全掃描。
1.4.7 統(tǒng)計分析 采用VisuTrack 嚙齒動物行為視頻分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司)分析高架數(shù)據(jù)。通過IBM SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并采用Origin 軟件繪制數(shù)據(jù)圖。
通過GC/MS 對2 種精油的成分進行了檢測,EO1 共鑒定出65 種精油成分,為檢出成分的97.48%,EO2 共鑒定出74 種精油成分,為檢出成分的97.42%,并對百分含量>1%的成分進行了歸類統(tǒng)計分析,見表1。含量>1%的成分主要是烯烴、醇類及酯類3 種化合物,其中含量最高的是乙酸芳樟酯,2 種精油分別為26.99%、27.83%,其次是芳樟醇,EO1 和EO2 依次為20.17%、19.61%;2 種精油雖然在主成分上具有一定的相似性,但是其他成分在含量和種類上存在一定的差別,比如EO1 沒有檢測出α-檀香醇,EO2 沒有檢測出α-柏木烯、羅漢柏烯、柏木腦等。2 種精油相對含量較高的成分雖然大致一致,都是以薰衣草的主要成分(芳樟醇、乙酸芳樟酯和乙酸薰衣草酯)為主,但同時也存在一些差別,根據(jù)成分決定功效,可以推測2 種精油在后續(xù)的試驗中也可能在某些方面具有不同的作用結果。
表1 2 種精油成分>1%的種類及含量
在高架十字迷宮測試中考察了各組小鼠進入開放臂及閉合臂的次數(shù)、時間,以及進入開放臂的小鼠比例等,見表2。結果發(fā)現(xiàn),空瓶刺激造模后進入開放臂的小鼠數(shù)量減少、進入次數(shù)OE 減少,且與CK 組相比差異顯著(P<0.05)、停留時間OT 減少,但活動的總路程增加;在注射咖啡因后,進入開放臂的小鼠數(shù)量增加、進入次數(shù)OE 增加、停留時間OT 增加,活動的總路程也增加;給空瓶+咖啡因的小鼠注射DZP 后,全部參與試驗的小鼠都進入了開放臂、進入次數(shù)OE 增加,且與空瓶刺激組相比差異顯著(P<0.05)、停留時間OT 增加,活動的總路程增加,與空瓶+咖啡因組相比差異顯著(P<0.05);而給空瓶+咖啡因的小鼠嗅聞精油后,2個組進入開放臂的小鼠數(shù)量減少了,EO1 組進入次數(shù)OE 和停留時間OT 減少,EO2 組進入次數(shù)OE 和停留時間OT 增加,活動的總路程都較空瓶+咖啡因組增加。
對實施空瓶刺激和咖啡因注射后的模型組進行戊巴比妥誘導睡眠試驗,觀察小鼠的睡眠情況,見表3。結果發(fā)現(xiàn),模型組入睡率降低至50%,入睡潛伏期延長,睡眠持續(xù)時間縮短,睡眠片段增加;給模型組注射DZP 后,所有參與試驗的小鼠均入睡,而且入睡潛伏期縮短,與模型組相比差異顯著(P<0.05),睡眠時間延長,且與模型組相比差異顯著(P<0.05),中途只蘇醒1 次;給模型組嗅聞精油后,2個精油組的入睡率均增加達到80%以上,EO1 組入睡潛伏期明顯縮短與模型組相比差異顯著(P<0.05),睡眠時間延長,中途也只蘇醒1 次,而EO2組入睡潛伏期卻延長了,且睡眠時間也縮短了,睡眠片段增加。有研究已證明,睡眠中斷會惡化情緒[21-22]并加劇焦慮相關癥狀[23],從睡眠行為表現(xiàn)上看,EO1效果明顯優(yōu)于EO2,但比DZP 效果稍差。
2.4.1 精油干預后對皮質醇(Cortisol)的影響 大量研究已經(jīng)表明,皮質醇含量與焦慮情緒有著直接關系,在一定范圍內,皮質醇的含量越低,焦慮程度就越輕。本研究完成各組處理后,對各組按試驗方法進行采血,并取其血清,通過酶聯(lián)免疫法檢測各處理組血清中Cortisol 的含量,見圖1。結果發(fā)現(xiàn),與CK組相比造模后,模型組Cortisol 含量明顯升高,差異顯著(P<0.05);將模型組隨機分為3 組,一組給予陽性藥DZP,一組嗅聞EO1,最后一組嗅聞EO2,3 組Cortisol 的含量都降低了,并且DZP 組與模型組相比,具有顯著性差異(P<0.05)。2 個精油組與模型組相比,具有極顯著性差異(P<0.01)。這說明陽性藥與精油對焦慮都有一定的緩解效果。
圖1 血清中皮質醇的含量
2.4.2 精油干預后對γ 氨基丁酸(GABA)的影響GABA 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種最重要的抑制性神經(jīng)遞質,通過一系列生化反應后,對機體具有鎮(zhèn)靜、催眠的效果[24]。有研究也發(fā)現(xiàn),大腦中GABA 含量水平的降低,與焦慮癥、抑郁癥等發(fā)生有一定聯(lián)系[25]。本研究對各處理組采血后,立即處死,分離出下丘腦、垂體,勻漿后,提取上清液,檢測其中GABA 的含量,見圖2。造模后,模型組中GABA 的含量與CK 組相比明顯降低,具有極顯著性差異P<0.01;將模型組隨機分為3組,一組給予陽性藥DZP,一組嗅聞EO1,最后一組嗅聞EO2,處理后,3 組GABA 的含量都有所增加,且EO1 組與模型組相比,具有顯著性差異(P<0.05),EO2與模型組相比,達到了極顯著性差異(P<0.01),EO2組與DZP 組相比,也具有極顯著差異(P<0.01),2 個精油組相比,也具有顯著性差異(P<0.05);與CK 相比,EO2 組GABA 恢復效果最好,甚至高于CK 組。
圖2 下丘腦、垂體中分泌γ 氨基丁酸(GABA)的含量
2.4.3 精油干預后對多巴胺(DA)的影響 DA 是普遍存在于動物和人神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的神經(jīng)遞質,降低DA 的水平可導致抑郁,表明DA 與焦慮、抑郁之間有著密切的關系[26]。同時,DA 也與睡眠之間存在一定的關系,榮霏等[27]研究發(fā)現(xiàn),對大鼠實施慢性睡眠剝奪后,其下丘腦中DA 的含量減少。本研究分析了各處理組中下丘腦、垂體中分泌的DA 含量,見圖3。造模組中,DA 含量與CK 相比顯著降低(P<0.01);造模組給予DZP 或EO2 后,DA 有所上升,但都不具有顯著性差異。當讓造模組嗅聞EO1精油后,與模型組相比,DA 的含量明顯上升,具有極顯著性差異(P<0.01),并與CK 接近;EO1 組與DZP 組和EO2 組相比,DA 的含量都較之高,且具有顯著性差異(P<0.05)。
圖3 下丘腦、垂體中分泌多巴胺(DA)的含量
2.4.4 精油干預后對去甲腎上腺素(NE)的影響去甲腎上腺素是一種主要由藍斑(LC)產(chǎn)生的神經(jīng)遞質,它與情緒處理和調節(jié)中心(例如杏仁核)具有雙向連接,并抑制投射到睡眠-覺醒調節(jié)的主要樞紐[28]。本研究分析了各處理組中下丘腦、垂體中分泌的NE 含量,見圖4。造模后,檢測出模型組NE的含量與CK 組相比,明顯下降,具有極顯著差異(P<0.01);對模型組給予DZP、EO1、EO2 不同處理后,下丘腦、垂體中分泌的NE 含量都有所上升,DZP 組與模型組相比,具有顯著性差異(P<0.05),2個精油組與模型組相比,都具有極顯著差異(P<0.01);并且2 個精油組與DZP 組相比,都達到了顯著性差異(P<0.05)。
圖4 下丘腦、垂體中分泌去甲腎上腺素(NE)的含量
2.4.5 精油干預后對乙酰膽堿(ACH)的影響 乙酰膽堿是一種在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)合成的喚醒神經(jīng)遞質,包括但不限于紋狀體復合體、基底前腦、間腦、腦橋腦細胞群和髓質,在清醒和快速眼動睡眠期間膽堿能活動較多,在非快速眼動睡眠期間膽堿能活動較少[29]。本研究分析了各處理組中下丘腦、垂體中分泌的ACH 含量,見圖5。造模后,模型組的ACH 含量與CK 組相比有明顯下降,具有極顯著性差異(P<0.01);給予造模組實施不同處理后,發(fā)現(xiàn)DZP 組、EO1 組和EO2 組的ACH 含量都有所上升,并且與造模組相比,DZP 組和EO1 組,都具有顯著性差異(P<0.05),而EO2 組與造模組相比,達到了極顯著性差異(P<0.01);雖然EO1 組和EO2 組上升值都高于DZP 組,但它們之間不存在顯著性差異。
圖5 下丘腦、垂體中分泌乙酰膽堿(ACH)的含量
2.4.6 精油干預后對組胺(HIS)的影響 組胺被認為是促進清醒的“主要”神經(jīng)遞質,抑制組胺可以促進入睡并增加非快速眼動(NREM)睡眠即慢波睡眠[30]。本研究分析了各處理組中下丘腦、垂體中分泌的HIS 含量,見圖6。造模后,模型組下丘腦、垂體中分泌的HIS 含量與CK 組相比,HIS 的含量增加了,具有顯著性差異(P<0.05);對造模組實施不同處理后,發(fā)現(xiàn)DZP 組、EO1 組和EO2 組的HIS 含量都有所減少,其中DZP 組與模型組相比,差異顯著(P<0.05),EO1 組和EO2 組與模型組相比,都達到了極顯著性差異(P<0.01);2 個精油組與DZP 組相比,HI S 的含量都減少了,且都表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05),2個精油組之間雖然也有差異,但差異不顯著。
圖6 下丘腦、垂體中分泌組胺(HIS)的含量
試驗中用到的2 種精油從成分上來看,主成分相差不大,都是以乙酸芳樟酯、芳樟醇、檸檬稀、乙酸薰衣草酯為主,但從后面的行為學和神經(jīng)遞質/神經(jīng)調節(jié)劑的分析來看,2 種精油功效上還是存在差異,由此可見,并不是主要成分相近,精油的功效就會一致,它還受其他特征性或微量成分的影響。由此可以推論考慮某種精油是否具有某種功效或者能達到想要的效果,并不能簡單的只看精油名稱或者其中的主要成分,關鍵還是要聚焦精油的成分組成。
試驗結果也發(fā)現(xiàn),行為測定結果和神經(jīng)遞質/神經(jīng)調節(jié)劑的檢測結果并不是對應一致的,從行為測試看陽性試劑要優(yōu)于精油的表現(xiàn),但神經(jīng)遞質/神經(jīng)調節(jié)劑的測定趨勢則為精油優(yōu)于陽性試劑,推測可能有2 個原因,一方面該試驗屬于急性測試,由神經(jīng)遞質/神經(jīng)調節(jié)劑的趨勢可能還未顯現(xiàn)出來;另一方面睡眠受到多因素的調節(jié),除了試驗中檢測的物質外,還有其他物質參與其中。但總體而言,從本研究檢測的神經(jīng)遞質/神經(jīng)調節(jié)劑來看,2 種精油在睡眠和情緒的緩解中都發(fā)揮了積極的作用,具有深入研究的價值。
總之,通過對上述神經(jīng)遞質/神經(jīng)調節(jié)劑的檢測分析,發(fā)現(xiàn)在進行焦慮協(xié)同咖啡因致小鼠失眠造模后,Cortisol、GABA、DA 和NE 等與CK 組相比都發(fā)生了變化,并且都具有顯著性差異。因此,筆者認為這些物質可能都與該模型下的失眠有一定的聯(lián)系,而且在進行陽性藥及精油處理后這些物質也發(fā)生了相應的改變,精油的正趨勢也優(yōu)于陽性藥,但神經(jīng)遞質/神經(jīng)調節(jié)劑對神經(jīng)系統(tǒng)的作用是一個復雜的過程,它涉及傳遞、相互影響等,其作用機理值得我們進一步探討。