劉文明，華明艷，宋蘭芳，崔少杰，孫海波，金鳳媚

（天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300384）

近年來番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）成為繼TY 之后的又一危害重大的病害。TSWV 是布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的典型成員，可感染84 個(gè)科的1 000多種雙子葉和單子葉植物[1]。該病毒主要通過薊馬傳播，由于該病毒危害性極強(qiáng)，目前已被列為世界第二大危害的植物病毒[2]。

該病最早于1915 年在澳大利亞發(fā)現(xiàn)[3]，已在美國[4-5]、伊朗[6]、南非[7]、韓國[8]、印度[9]等多個(gè)番茄產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重的損失。我國于20 世紀(jì)80 年代在番茄和煙草中首次檢出番茄斑萎病毒[10]，之后隨著薊馬危害范圍逐年擴(kuò)大，番茄斑萎病毒在我國多地的多種園藝植物上被發(fā)現(xiàn)[11-14]。由于TSWV 的植物宿主范圍廣泛，生產(chǎn)中很難預(yù)防該病，所以將TSWV 抗性基因?qū)敕哑贩N已被認(rèn)為是一種行之有效的預(yù)防方法。

在栽培番茄和野生番茄中均發(fā)現(xiàn)了抗TSWV的遺傳資源，但抗性水平不相一致。迄今為止，已報(bào)道了8 個(gè)對(duì)TSWV 具有抗性基因，分別是Sw1a、Sw1b、sw2、sw3、sw4、Sw-5、Sw-6 和Sw-7[15-17]。在這些基因中，來自秘魯番茄的Sw-5 基因已被確定對(duì)多種布尼亞病毒科病毒有持久抗性[18]。Sw-5 有5 個(gè)等位基因（Sw-5a、Sw-5b、Sw-5c、Sw-5d、Sw-5e）和7個(gè)同源基因分別分布在9 號(hào)染色體和12 號(hào)染色體上[19-20]，其中含有Sw-5b 是對(duì)TSWV 有抗性的功能型基因，其基因序列已發(fā)表在GenBank（AY007366）[21]。Sw-5b 可以限制病毒在體內(nèi)的廣泛傳播，僅表現(xiàn)為輕微的過敏性反應(yīng)。因此，很多育種工作者將該基因作為重點(diǎn)研究對(duì)象，并在番茄育種中得到廣泛應(yīng)用[22]。

針對(duì)Sw-5b 基因，Shi 等[23]已開發(fā)出一個(gè)基因特異性PCR 標(biāo)記，但此標(biāo)記僅能擴(kuò)增出抗病基因，對(duì)感病基因卻無能為力；Lee 等[24]開發(fā)出一個(gè)基于高分辯率熔解曲線HRM（High-Resolution Melting，HRM）的分子標(biāo)記方法，但該方法需要用到昂貴的儀器，不能在普通實(shí)驗(yàn)室普及。本研究是在Shi 等[23]研究的基礎(chǔ)上，利用AS-PCR 方法開發(fā)出一種費(fèi)用低廉的PCR 方法檢測(cè)Sw-5b。該方法可區(qū)分出抗感基因型且操作簡單，適合在一般實(shí)驗(yàn)室普及。本方法可加快抗病育種進(jìn)程，對(duì)推進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

抗病純合：‘LA3667’。

感病純合：‘cy299-6’。

雜合型：‘3110’為‘LA3667’בcy299’獲得的F1 代。

市售商品種：‘1679’‘津雜213’‘津雜214’‘圣迪’‘齊達(dá)利’‘Sibeide’。

表1 材料來源

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 番茄材料于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院番茄育種基地種植，并正常管理。采用CTAB法提取番茄葉片總DNA。

1.2.2 抗感品種Sw-5b 基因部分片段克隆 參照文獻(xiàn)[23]設(shè)計(jì)的Sw-5b-f1/r1 引物擴(kuò)增抗病基因型材料和感病基因型材料。Sw-5b-f1:5'-AACCACTAG GGGCAGTCCTT-3'，Sw-5b-r1:5'-CTCACTATGTGGC TGCTCCA-3'。將獲得的片段進(jìn)行克隆和測(cè)序。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，模板DNA 40 ng，Taq DNA 聚合酶0.5 U，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL，10×PCR 緩沖液2.5 μL，5'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL，3'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃熱啟動(dòng)之后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。循環(huán)條件為：95 ℃變性5 min，95 ℃30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次，72 ℃過度延伸10 min。將所有反應(yīng)物混勻后，于PCR 儀（MJ PTC-200）上擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。采用奧萊博有限公司的瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，將其進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆，在Takara 公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 抗性基因特異性引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)等位基因特異性的引物。為了在不同材料中檢測(cè)目標(biāo)SNP（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），采用AS-PCR 方法，設(shè)計(jì)特異的上游引物，將SNP置于引物的3′端的不同位置并在特異性引物的3′端引入錯(cuò)配堿基，以增強(qiáng)AS-PCR 的擴(kuò)增效果。利用Primer3（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）再設(shè)計(jì)一個(gè)公用下游引物。特異性引物的3'端分別與抗病品種和感病品種的SNP 位點(diǎn)相匹配。與特異性引物相匹配的等位片段有擴(kuò)增產(chǎn)物，不匹配的沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 PCR 反應(yīng)體系 反應(yīng)總體積為25 μL，包括模板DNA40 ng，Taq DNA 聚合酶0.5 U，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL，10×PCR 緩沖液2.5 μL，5'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL，3'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃熱啟動(dòng)之后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。循環(huán)條件為：95 ℃變性5 min，95 ℃30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次，72 ℃過度延伸10 min。退火溫度視引物而定。將所有反應(yīng)物混勻后，于PCR 儀上擴(kuò)增（MJPTC-200）。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料的測(cè)序驗(yàn)證

將含有抗病基因的品種‘LA3667’和含有感病基因的品種‘cy299-6’進(jìn)行克隆，經(jīng)PCR 檢測(cè)為陽性的克?。▓D1）送到上海生工公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病品種在3 處有SNP，327 和329 及371 處（圖2）。通過美國國家生物信息中心NCBI 的GeneBank 對(duì)比，證明克隆獲得的片段為番茄Sw-5b基因及其等位基因（GenBank:AY007366）。

圖1 引物Sw-5b-f1/r1 的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 包含SNP 的序列片段

2.2 依測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物

選定包括327 和329 等位基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列片段作為檢測(cè)抗病基因型的擴(kuò)增區(qū)。設(shè)計(jì)rg1-F 至rg5-F 作為上游引物，引物rg-R 為下游公用引物，產(chǎn)物大小約為720 bp（表2）。選定包括371 等位基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列片段作為檢測(cè)感病基因型的擴(kuò)增區(qū)。設(shè)計(jì)sg1-F 至sg4-F 作為上游引物，引物sg-R 為下游公用引物，產(chǎn)物大小約為250 bp（表3）。

rg1-F 是來自抗病基因型的原始序列，3' 端正好位于329 突變處。引物rg2-F 與rg1-F 序列相同，但3'端第二個(gè)堿基的G 被C 取代，形成C-C 錯(cuò)配。同樣地，引物rg3-F 3'端第二個(gè)堿基的G 被A 取代，形成A-C 錯(cuò)配；引物rg4-F 3'端第2 個(gè)堿基的G 被T 取代，形成T－C 錯(cuò)配。為了檢測(cè)錯(cuò)配位置對(duì)PCR 結(jié)果的影響，設(shè)計(jì)了引物rg5-F。該引物與引物rg3-F 相同，但位置不同，位于3'端的第5 個(gè)位點(diǎn)（表2）。

表2 檢測(cè)抗病基因型特異性PCR 引物

引物sg1-F 是來自感病基因型的原始序列區(qū)域，3'端正好位于371 突變處。引物sg2-F、sg3-F、sg4-F 分別在3'端第2 個(gè)位點(diǎn)引入G-G、A-G、T-G錯(cuò)配（表3）。

表3 檢測(cè)感病基因型特異性PCR 引物

2.3 不同引物在抗病品種中的擴(kuò)增結(jié)果

引物rg1-F 是以抗病品種的原序列為引物，將2 個(gè)SNP 堿基置于引物的3′端，rg-R 為擴(kuò)增抗病基因型的公共下游引物。結(jié)果表明，退火溫度在55～63 ℃的范圍內(nèi)，抗病品種和感病品種中均擴(kuò)增了相應(yīng)大小的條帶。這證明該引物不能有效阻止基因與引物的錯(cuò)配，從而不能有效區(qū)分抗感品種（圖3 中的泳道1、2、3）。鑒于此，引物rg2-F、rg3-F 和rg4-F 4在設(shè)計(jì)時(shí)將2 個(gè)SNP 之間的位點(diǎn)引入錯(cuò)配堿基。筆者發(fā)現(xiàn)不同的錯(cuò)配類型對(duì)PCR 的結(jié)果有影響。引物rg2-F 和rg4-F 分別由G 換成C，形成C-C 錯(cuò)配和由G 換成T，形成T-C 錯(cuò)配，在擴(kuò)增時(shí)均可擴(kuò)增出條帶，不能區(qū)分出抗感基因型（圖3 中的泳道4～9）。引物rg5-F 設(shè)計(jì)原理與rg3-F 相同，但錯(cuò)配位置放在了3′端第5 位。結(jié)果表明，在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)退火溫度在55～60 ℃時(shí)擴(kuò)增不穩(wěn)定。引物rg3-F 引入AC 錯(cuò)配的引物在退火溫度為63°C 可以擴(kuò)增出抗病基因型而感病基因型沒有得到擴(kuò)增（圖4）。因此，引物rg3-F 可以有效區(qū)分出抗感基因型。

圖3 引物rg1-F,rg2-F 和rg4-F 擴(kuò)增結(jié)果

圖4 引物rg3-F 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 感病品種不同引物的擴(kuò)增結(jié)果

在感病品種的特異性引物的設(shè)計(jì)中，引物sg1-F、sg2-F、sg3-F、sg4-F 的設(shè)計(jì)原理同抗病引物rg1-F、rg2-F、rg3-F、rg4-F 的設(shè)計(jì)。sg2-F、sg3-F、sg4-F分別引入了G-G、A-G 和T-G 錯(cuò)配。利用這3 個(gè)引物對(duì)抗病基因型和感病基因型進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，退火溫度從45°C 升高到60°C，2 種基因型中均未擴(kuò)增出條帶，從而不能區(qū)分出抗感基因型（圖5 泳道4～12）。引物sg1-F 為未引入任何錯(cuò)配堿基的引物，在擴(kuò)增時(shí)退火溫度提高到59～60°C 時(shí)，在感病基因型中能擴(kuò)增出250 bp 的條帶，而抗病基因型不能被擴(kuò)增（圖5 泳道1～3）。所以引物sg1-F 能有效區(qū)分出抗感基因型。

圖5 引物sg1-F, sg2-F, sg3-F 和sg4-F 的擴(kuò)增結(jié)果

2.5 退火溫度的確定

退火溫度是AS-PCR 擴(kuò)增的重要因素。用引入A-C 錯(cuò)配的引物rg3-F/rg-R 在退火溫度范圍60～62 ℃時(shí)，所有基因型都能擴(kuò)增出720 bp 的目的條帶，但感病基因型的條帶隨退火溫度的升高而逐漸減弱。63 ℃時(shí)，只有抗病基因型和雜合基因型的條帶被擴(kuò)增，而感病基因型的條帶不能被擴(kuò)增（圖6），所以確定63°C 是臨界退火溫度。

圖6 引物rg3-F/rg-R 在不同溫度下的擴(kuò)增結(jié)果

當(dāng)檢測(cè)感病基因位點(diǎn)時(shí)，引物對(duì)sg1-F/sg-R 在退火溫度范圍為59～60°C 時(shí)能夠區(qū)分不同的基因型。當(dāng)退火溫度高于60°C 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定，并且低于59°C時(shí)抗病基因型和感病基因型均能擴(kuò)增出目的條帶。

2.6 特異性引物有效性的驗(yàn)證

利用篩選出來的特異性PCR 引物rg3-F/rg-R和sg1-F/sg-R 對(duì)市售番茄品種‘1679’‘津雜213’‘津雜214’‘圣迪’‘齊達(dá)利’‘Sibeide’進(jìn)行驗(yàn)證。利用引物rg3-F/rg-R 擴(kuò)增時(shí)，‘Sibeide’‘1679 能夠擴(kuò)增出720 bp 的目的條帶（圖7-A），而其他4 個(gè)品種未擴(kuò)增出條帶。利用引物sg1-F/sg-R 擴(kuò)增時(shí)，‘津雜213’‘津雜214’‘圣迪’‘齊達(dá)利’‘Sibeide’和‘1679’能夠擴(kuò)增出250 bp 的目的條帶（圖7-B）。這表明‘Sibeide’‘1679’為雜合型的品種，‘津雜213’‘津雜214’‘圣迪’‘齊達(dá)利’為感病基因型品種。利用引物Sw5b-f1/r1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果表明‘Sibeide’‘1679’在327、329 和371 位點(diǎn)分別為C/T、G/A 和C/T（圖8-A），而‘津雜213’‘津雜214’‘圣迪’‘齊達(dá)利’分別為T、A 和T（圖8-B）。這個(gè)結(jié)果與利用特異性引物rg3-F/rg-R 和sg1-F/sg-R檢測(cè)的結(jié)果一致。直接測(cè)序法是檢測(cè)SNP 的標(biāo)準(zhǔn)[25]，本試驗(yàn)用直接測(cè)序法對(duì)6 份市售番茄材料進(jìn)行分析，驗(yàn)證了該體系能有效區(qū)分出不同的SNP類型。

圖7 引物rg3-F/rg-R(A)和sg1-F/sg-R(B)擴(kuò)增結(jié)果

圖8 不同基因型的測(cè)序結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 錯(cuò)配堿基的篩選

在AS-PCR 方法中，選擇特異性引物至關(guān)重要。為了提高擴(kuò)增的穩(wěn)定性，在特定引物中引入了錯(cuò)配堿基。在篩選檢測(cè)抗病基因型的特異引物時(shí)，在2個(gè)SNP（327、329）之間引入了C-C、A-C 和T-C 錯(cuò)配。大量試驗(yàn)表明，引入A-C 錯(cuò)配堿基的引物rg3-F，在抗病基因型和雜合基因型中均可觀察到目標(biāo)帶。據(jù)報(bào)道，A-C 錯(cuò)配較弱，T-C 錯(cuò)配較強(qiáng)，C-C 錯(cuò)配中等[26]。本研究中，錯(cuò)配位置是在2 個(gè)SNP 之間，這2 個(gè)SNP 分別為C 和G，它們比T 和A 更穩(wěn)定，因此，為了平衡強(qiáng)度，需要引入弱錯(cuò)配。此外，引入中度錯(cuò)配或強(qiáng)錯(cuò)配的引物rg2-F 和rg4-F 均可以擴(kuò)增出720 bp 的目的條帶，這表明它們不能阻止引物和模板的結(jié)合。

據(jù)報(bào)道，引物3′端的1 個(gè)堿基錯(cuò)配通常不能完全抑制引物與模板的結(jié)合[27]。在本研究中，篩選感病基因型特異引物的時(shí)，引入了中度錯(cuò)配（G-G，sg2-F）、強(qiáng)錯(cuò)配（A-G，sg3-F）、弱錯(cuò)配（T-G，sg4-F）和無錯(cuò)配（引物sg1-F）。只有引物sg1-F 能區(qū)分不同的基因型，而其他引物均不能擴(kuò)增出條帶。371 位的SNP 相鄰的堿基為G 和C，相比于T 和A，它們更穩(wěn)定。因此，任何錯(cuò)配都可以防止堿基結(jié)合。所以，是否在特定的堿基中引入錯(cuò)配，取決于相鄰的堿基類型。

3.2 錯(cuò)配位置的影響

在篩選抗性基因型特異性引物時(shí)，使用rg5-F，即A-C 錯(cuò)配堿基位于3′末端的第五位（與SNP 不相鄰），在PCR 擴(kuò)增時(shí)不穩(wěn)定（有時(shí)觀察到帶，有時(shí)沒有觀察到）。而使用rg3-F，即A-C 錯(cuò)配位置在3′末端的第2 個(gè)堿基（與相鄰SNP），能擴(kuò)增出預(yù)期條帶。因此，錯(cuò)配的位置影響擴(kuò)增的穩(wěn)定性，結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致[26]。這一結(jié)果可能與堿基堆積力、氫鍵以及三維結(jié)構(gòu)有關(guān)，也可能與錯(cuò)配堿基和DNA 聚合酶相互作用引起的空間位阻有關(guān)[28]。

3.3 退火溫度的影響

退火溫度是決定PCR 的靈敏度和清晰度的主要因素。較低的退火溫度有利于兩者的結(jié)合，但也非常容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增；較高的退火溫度雖然不容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，卻會(huì)導(dǎo)致引物和模板結(jié)合困難從而使擴(kuò)增效率降低。因此，退火溫度是PCR的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[29]。在本研究中，不同引物的退火溫度相差很大，檢測(cè)抗病基因的引物rg3-F 退火溫度達(dá)到了63 ℃，而檢測(cè)感病基因的引物sg1-F 則為59～60 ℃。推測(cè)這與引物中GC 含量有很大關(guān)系，rg3-F 的GC含量為59%，sg1-F 的GC 含量為33%，GC 含量越高退火溫度越高。與普通PCR 退火溫度有很大的范圍不同，本研究中的引物對(duì)溫度很敏感，只有在很小的溫度范圍內(nèi)能區(qū)分不同基因型，引物對(duì)rg3-F/rg-R 只有在63 ℃時(shí)才能區(qū)分抗病和感病基因型，感病基因的引物sg1-F/sr-R 則退火溫度為59～60 ℃。這可能是因?yàn)槠胀≒CR 在擴(kuò)增中沒有其它模板的競爭，而等位基因特異性PCR 在擴(kuò)增體系內(nèi)存在2 個(gè)模板的競爭。

3.4 SNP 的檢測(cè)方法

SNP 是植物基因組中常見且豐富的變異。SNP的檢測(cè)方法很多，如高分辨率熔解曲線(HRM)[30]、DNA 微陣列[31]、和KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP）[32]。但是這些技術(shù)需要精密的設(shè)備，因此這些方法不適用于常規(guī)的、大規(guī)模的、商業(yè)化的遺傳分析。在本研究中，不同的基因型可以通過一般的PCR 技術(shù)來區(qū)分，該方法快速有效，適用于番茄抗TSWV 育種。

在本研究中，利用引物rg3-F/rg-R 及sg1-F/sg-R 進(jìn)行AS-PCR，能夠有效區(qū)分番茄的不同基因型，該方法為番茄育種工作者在番茄抗TSWV 育種中篩選Sw-5b 抗性基因提供了有力的工具。