徐亞英，李志敏

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237）

釀酒酵母是衣康酸生物合成的細(xì)胞工廠之一[1-2]。廉價(jià)易得的葡萄糖是衣康酸生產(chǎn)的主要碳源，但是釀酒酵母的葡萄糖效應(yīng)是衣康酸生產(chǎn)的限制因素，不能進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）途徑的丙酮酸溢流使得培養(yǎng)基中積累乙醇和甘油，而TCA 途徑和乙醛酸途徑提供衣康酸合成的重要前體檸檬酸，在葡萄糖利用階段被抑制[3-5]。有研究證明釀酒酵母的溢流現(xiàn)象是由于葡萄糖效應(yīng)限制了呼吸能力，即葡萄糖效應(yīng)使得酵母線粒體無(wú)力消化糖酵解途徑（EMP）快速積累的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），利用NADH 氧化酶（NOX）和可替代氧化酶（AOX1）可以減弱葡萄糖效應(yīng)[6-7]和降低NADH 水平，從而減少了甘油和乙醇產(chǎn)量。但是在恒化培養(yǎng)條件下，葡萄糖仍然處于限制狀態(tài)，因此需要了解分批培養(yǎng)高糖情況下NADH水平的擾動(dòng)對(duì)釀酒酵母葡萄糖效應(yīng)的影響。

釀酒酵母胞質(zhì)中過(guò)量的NADH 一般會(huì)先被NADH脫氫酶NDE1 和NDE2 氧化，超出其氧化能力的NADH會(huì)被3-磷酸甘油脫氫酶(GPD)氧化[8-9]。GPD 催化NADH 依賴的磷酸二羥丙酮 (DHAP) 轉(zhuǎn)化為 3-磷酸甘油，后者通過(guò)DL-3-磷酸甘油進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甘油[10-12]。兩種同工酶 GPD1p 和 GPD2p 產(chǎn)生GPD 活性，GPD1p的表達(dá)受高滲透壓甘油反應(yīng)途徑的調(diào)節(jié)，而 GPD2p的表達(dá)隨著對(duì)胞質(zhì)NADH 再氧化需要的增加而增加[10,13]。本文嘗試?yán)貌煌截愘|(zhì)粒表達(dá)nox基因來(lái)減少甘油的積累，并且替換了釀酒酵母的gpd2基因，利用啟動(dòng)子Pgpd2控制nox基因 (來(lái)自Streptococcus pneumoniae)的表達(dá)[14-15]。理論上當(dāng)胞質(zhì)NADH 過(guò)量時(shí)啟動(dòng)子Pgpd2會(huì)上調(diào)nox的基因表達(dá)，以氧化胞質(zhì)過(guò)量的NADH，避免碳源損失到甘油。另一方面，葡萄糖生產(chǎn)的丙酮酸大部分無(wú)法進(jìn)入TCA 循環(huán)，導(dǎo)致其經(jīng)丙酮酸脫羧酶(PDC)和乙醛脫氫酶(ALD)反應(yīng)形成乙醛和乙醇。為減少葡萄糖生產(chǎn)衣康酸過(guò)程中乙醇副產(chǎn)物的積累，本文還在高、低拷貝質(zhì)粒中外源表達(dá)了來(lái)自H.capsulatum的替代氧化酶AOX1(GenBank AF133236 )[16]，并利用釀酒酵母線粒體定位信號(hào)與AOX1 融合表達(dá)，以減少AOX1 對(duì)胞質(zhì)NADH氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 背景菌株是釀酒酵母BY4741（下文簡(jiǎn)稱BY4741），質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中進(jìn)行，利用DH5a作為感受態(tài)，pRS415、pRS413、pRS423、pRS425 作為穿梭質(zhì)粒。本文所用的菌株和質(zhì)粒分別詳見(jiàn)表1、表2。

表2 本文所使用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this paper

1.1.2試劑 DNA 聚合酶購(gòu)自寶（大連）生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB(北京)有限公司；酵母基因組提取試劑盒和大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司；MitoTracker?GreenFM線粒體綠色熒光探針購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；序列測(cè)定由上海派森諾生物科技有限公司完成。酵母提取物（YeastExtract）購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；蛋白胨（Peptone)、無(wú)氨基酵母氮源(YNB)培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖和培養(yǎng)基用無(wú)機(jī)鹽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；各種氨基酸購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。文中所用試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基 大腸桿菌種子培養(yǎng)基（g/L）：LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(酵母提取物5、蛋白胨10 和NaCl10)，用于大腸桿菌的生長(zhǎng)，固體培養(yǎng)基則還需要添加瓊脂粉1.5～1.6g/L；轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)需要添加氨芐青霉素至質(zhì)量濃度100μg/mL。釀酒酵母種子培養(yǎng)基（g/L）：YPD（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）培養(yǎng)基（酵母提取物10、蛋白胨20 和葡萄糖20），固體培養(yǎng)基則還需要添加瓊脂粉2g/L，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行基因整合時(shí)還需要添加諾爾絲菌素和潮霉素分別至質(zhì)量濃度100μg/mL 和500μg/mL。釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，YNB1.7，(NH4)2SO45，氨基酸缺失補(bǔ)充劑dropout等[17]。葡萄糖單獨(dú)滅菌，滅菌條件：115℃，30min。YNB（Yeast NitrogenBase）、(NH4)2SO4 和dropout 等配制成10×母液，0.22μm 無(wú)菌薄膜濾菌器過(guò)濾除菌。

1.1.4引物 文中所用引物詳見(jiàn)表3。

表3 本文所使用的引物Table 3 Primers used in this paper

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建和基因整合nox，mCherry基因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室所有，aox1基因由金唯智公司合成，本文中使用的所有啟動(dòng)子和終止子都從釀酒酵母S288C 基因組擴(kuò)增得到，aac2、bcs1p基因擴(kuò)增自釀酒酵母S288C 基因組。本文中質(zhì)粒大都使用無(wú)縫克隆試劑盒構(gòu)建，以質(zhì)粒pRS413-PGPD2-nox-TCYC1的構(gòu)建為例：其以釀酒酵母S288C 基因組為模板擴(kuò)增得到PGPD2啟動(dòng)子（引物zw-1F，zw-1R 擴(kuò)展）和TCYC1（引物zw-3F，zw-3R 擴(kuò)展），以肺炎鏈球菌基因組為模板擴(kuò)增得到基因nox（引物zw-2F，zw-2R），限制性內(nèi)切酶BamHI酶切質(zhì)粒pRS413 得到線性化載體，無(wú)縫克隆酶一步連接后鈣轉(zhuǎn)涂板，對(duì)菌落進(jìn)行PCR 得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。本文利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)進(jìn)行了基因整合實(shí)驗(yàn)，以GPD2△::nox為例：以pHYB 為模板，用引物zw-23F 和zw-23R 擴(kuò)增得到線性化載

體，DpnI 內(nèi)切酶酶切后鈣轉(zhuǎn)涂板，對(duì)菌落進(jìn)行PCR 得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子pHYB-sggpd2；以目的基因nox為模板，引物zw-24F 和zw-24R 擴(kuò)增得到Donor DNA，將質(zhì)粒pHYB-sggpd2和Donor DNA LiAC 轉(zhuǎn)化進(jìn)已經(jīng)含有質(zhì)粒pCAS9-NAT 的酵母菌，再進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，消質(zhì)粒后得到陽(yáng)性菌。

1.2.2重組菌的培養(yǎng) 將LEU 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的YSC（YeastSyntheticCompleteMedium）平板上的重組菌XYY21-XYY31、Z1 和Z2 接種到Y(jié)SC-LEU 培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)20～24h，將活化后的種子液接種到酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(含20g/L的葡萄糖)中，初始OD600值為0.1，在30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)120h，每12～24h取樣，搖瓶培養(yǎng)基裝液量為50mL，為了增加搖瓶中的氧濃度，后期搖瓶培養(yǎng)基裝液量為30mL。將YSC 平板上的重組菌L1～L3 和A1～A7 分別接種到Y(jié)SC-LEU和YSC-HIS 培養(yǎng)基，將活化后的種子液接種到酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(含20g/L的葡萄糖)中，初始OD600值為0.1，在30℃、220r/min 搖床中培養(yǎng)72h，14～20h取樣，染色后采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.3分析方法 通過(guò)測(cè)量600nm處的吸光度來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。甘油、乙醇和衣康酸的濃度通過(guò)高效液相色譜儀（HPLC）分析，使用aminexHPX-87H離子色譜柱（Bio-Rad，Hercules，USA）、折光率檢測(cè)器（RID-10A，ShimadzuCorporation，Kyoto，Japan）、UV檢測(cè)器（SPD-10A，Shimadzu Corporation）和LC Solutions系統(tǒng)（ShimadzuCorporation）。流動(dòng)相是流速為0.5mL/min的5mmol/LH2SO4 溶液。HPLC柱在 30 ℃ 下操作。

1.2.4熒光顯微鏡 A1～A7 和L1～L3 酵母細(xì)胞在搖瓶中培養(yǎng)14～20h 時(shí)取樣，離心收集細(xì)胞，去除上清，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）或者培養(yǎng)基YSC 沖洗1 次；用30℃預(yù)熱的PBS 緩沖液或者用培養(yǎng)基YSC 將細(xì)胞稀釋至OD600值為0.1（1×106cells/mL），加入MitoTracker?GreenFM線粒體綠色熒光探針使其終濃度為400nmol/L，在30℃、220r/min避光條件下孵育50min；染色完成后低速離心收集細(xì)胞，加入300μL PBS 緩沖液沖洗菌體；離心收集菌體，加入100μL PBS 緩沖液重懸菌體用于激光共聚焦顯微鏡觀察。與MitoTracker?GreenFM線粒體綠色熒光探針不同的是，DAPI(4,6-Diamidino-2-phenylindole)孵育15min，在緩沖液中終質(zhì)量濃度0.1μg/mL，其他條件相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 NADH 氧化酶NOX 對(duì)葡萄糖效應(yīng)中甘油合成的影響

為利用NADH 氧化酶NOX 減少釀酒酵母生產(chǎn)甘油，本文構(gòu)建了高低拷貝的nox基因表達(dá)載體（高拷貝表達(dá)載體PRS423-PGPD2-nox-TCYCI，低拷貝表達(dá)載體PRS413-PGPD2-nox-TCYCI來(lái)）減少胞質(zhì)過(guò)量的NADH。搖瓶培養(yǎng)結(jié)果表明（圖1（a）），利用低拷貝質(zhì)粒過(guò)表達(dá)nox基因時(shí)，24 h 葡萄糖全部消耗，培養(yǎng)基中甘油和乙醇的積累沒(méi)有受到明顯影響，24 h時(shí)菌株XYY23（含低拷貝表達(dá)質(zhì)粒）的甘油質(zhì)量濃度達(dá)到1.17 g/L，比對(duì)照菌株（XYY21（含低拷貝表達(dá)質(zhì)粒），1.39 g/L）減少了15.83%，衣康酸滴度比對(duì)照菌株也有一些減少。利用高拷貝質(zhì)粒表達(dá)nox（nox過(guò)表達(dá)菌株（XYY24））在24 h 生產(chǎn)甘油0.74 g/L，比對(duì)照菌（XYY22，1.32g/L）減少43.94%，且0～120 h時(shí)乙醇、乙酸、衣康酸濃度和酵母生長(zhǎng)都沒(méi)有受到明顯影響。

圖1 利用NADH 氧化酶NOX 減少甘油生產(chǎn)Fig.1 Reducing glycerol production with NADH oxidase NOX

利用CRISPR/CAS9 基因編輯技術(shù)將PGPD-cadATCYC1整合到釀酒酵母基因組的HO 位點(diǎn)，nox基因直接替換釀酒酵母的gpd2基因。搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基因nox替換gpd2成功減少了甘油的碳通量，培養(yǎng)基中的甘油積累從0.88 g/L 減少至0.49 g/L。菌株生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)生沒(méi)有受到明顯影響，但是整合菌株Z2 的衣康酸產(chǎn)量比XYY24降低（圖1（b））。

2.2 釀酒酵母表達(dá)外源替代氧化酶AOX1

本文構(gòu)建了高、低拷貝的aox1基因表達(dá)載體并通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)嘗試其干擾乙醇生產(chǎn)的效果，搖瓶培養(yǎng)結(jié)果顯示低拷貝載體表達(dá)aox1（XYY25）對(duì)代謝沒(méi)有明顯影響，而高拷貝表達(dá)aox1的酵母菌XYY26 在葡萄糖初始質(zhì)量濃度20 g/LYSC 培養(yǎng)基中的乙醇生產(chǎn)沒(méi)有減少，而是形成與XYY24 相似的效果，培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度由1.39 g/L 減少到0.91 g/L，減少了34.53%（圖2），與已有研究結(jié)果不同[6]。文獻(xiàn)報(bào)道NOX 定位在酵母細(xì)胞質(zhì)[6]，AOX1 定位在釀酒酵母的線粒體[15]，我們猜測(cè)菌株XYY26 中的AOX1 蛋白在胞質(zhì)有殘留，所以形成與PGPD2-nox表達(dá)菌XYY24 相似的效果。為了驗(yàn)證我們的猜測(cè)，本文利用熒光蛋白和熒光探針共定位實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察NOX 和AOX1 在釀酒酵母中的定位。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察（圖3），發(fā)現(xiàn)nox在啟動(dòng)子PGPD2控制下成功表達(dá)并且定位在釀酒酵母細(xì)胞質(zhì),而AOX1 主要集中在釀酒酵母的線粒體，但胞質(zhì)也有一些熒光殘留，這可能是因?yàn)锳OX1定位到線粒體的過(guò)程中在胞質(zhì)中殘留的原因，或者線粒體負(fù)載AOX1 過(guò)量的原因。

圖2 利用替代氧化酶AOX1 減少乙醇生產(chǎn)Fig.2 Reducing ethanol production by overexpressing an alternative oxidase AOX1

圖3 NOX(a)和AOX1(b)在釀酒酵母中的定位Fig.3 Location of NOX(a) and AOX1(b) in Saccharomyces cerevisiae

2.3 替代氧化酶AOX1 強(qiáng)化定位線粒體的作用

為了使AOX1 更好地集中定位到釀酒酵母的線粒體內(nèi)膜中，減少其對(duì)甘油生產(chǎn)的影響，本文找到了定位在線粒體內(nèi)膜且面向線粒體膜間空間的蛋白PET9/AAC2 和面向線粒體基質(zhì)的內(nèi)膜蛋白BCS1 的前導(dǎo)序列蛋白BCS1p，作為將AOX1 定位至線粒體內(nèi)膜的定位信號(hào)[19]。AAC2 是線粒體內(nèi)膜的主要ADP/ATP載體，其主要作用是用胞質(zhì)ADP 交換線粒體合成的ATP，但在某些條件下，如好氧指數(shù)生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基中時(shí)，其作用方向相反。BCS1 是復(fù)合物 III 組裝所需的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位酶和分子伴侶，AAA ATPase 家族的成員。從激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，AAC2 和BCS1p 都具有良好的線粒體定位效果（圖4）。

圖4 利用線粒體定位信號(hào)將替代氧化酶AOX1 定位至線粒體Fig.4 Further location of AOX1 in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae with mitochondrial localization signals

AAC2-AOX1 和BCS1p-AOX1 融合蛋白的搖瓶培養(yǎng)結(jié)果表明，24 h 時(shí)融合蛋白搖瓶培養(yǎng)的甘油產(chǎn)量相比AOX1 表達(dá)菌株沒(méi)有受到影響，乙醇、檸檬酸、丙酮酸的質(zhì)量濃度沒(méi)有明顯變化，36～72 h范圍內(nèi)衣康酸生產(chǎn)速度加快（圖5），所以認(rèn)為在AOX1的N 端添加線粒體內(nèi)膜定位信號(hào)有助于減少AOX1 胞質(zhì)定位，以減弱其對(duì)胞質(zhì)NADH 的影響。但是在初始葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L 的YSC 培養(yǎng)基中，aox1表達(dá)菌株依然受葡萄糖效應(yīng)影響從而產(chǎn)生大量乙醇，即沒(méi)能減緩高濃度初始葡萄糖培養(yǎng)基導(dǎo)致的葡萄糖效應(yīng)。有趣的是，bcs1p-aox1的表達(dá)能夠增加乙醇利用階段衣康酸的產(chǎn)量，這可能是因?yàn)閎cs1p-aox1增加了線粒體NADH 的代謝速度，部分解除了葡萄糖效應(yīng)對(duì)衣康酸合成路徑基因表達(dá)的抑制作用。

圖5 AOX1 線粒體定位提高衣康酸滴度Fig.5 Mitochondrial localization of AOX1 increases the titer of itaconic acid

3 討 論

利用釀酒酵母合成衣康酸面臨著葡萄糖效應(yīng)限制的問(wèn)題，本文探討了不同強(qiáng)度表達(dá)外源胞質(zhì)NADH氧化酶NOX 和線粒體可替代氧化酶AOX1 對(duì)釀酒酵母分批發(fā)酵葡萄糖效應(yīng)的影響。通過(guò)利用CRISPR/Cas9 將釀酒酵母的3-磷酸甘油脫氫酶GPD2替換為NADH 氧化酶NOX，減少了葡萄糖效應(yīng)導(dǎo)致的甘油碳代謝流的增加。在aox1基因過(guò)表達(dá)菌株的搖瓶實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)aox1基因過(guò)表達(dá)菌株沒(méi)有減少乙醇的得率，反而會(huì)干擾胞質(zhì)甘油的形成。所以本文利用線粒體內(nèi)膜定位信號(hào)AOX1 融合蛋白為AAC2-AOX1 和BCS1p-AOX1，將AOX1 進(jìn)一步定位至線粒體，減少了AOX1 對(duì)胞質(zhì)NADH 氧化的影響，雖然沒(méi)有改善葡萄糖效應(yīng)副產(chǎn)物乙醇的積累，但是增加了發(fā)酵培養(yǎng)36 h 之后產(chǎn)生的衣康酸的質(zhì)量濃度，120 h時(shí)衣康酸質(zhì)量濃度增加至116.98 mg/L。本文結(jié)果表明表達(dá)外源NADH 氧化酶NOX 和可替代氧化酶AOX1 在高糖培養(yǎng)基分批發(fā)酵過(guò)程中對(duì)葡萄糖效應(yīng)的影響，這有助于進(jìn)一步提高釀酒酵母工程菌利用葡萄糖生產(chǎn)TCA 循環(huán)衍生物，但是需要進(jìn)一步研究如何減少葡萄糖效應(yīng)副產(chǎn)的乙醇積累問(wèn)題。

全基因組復(fù)制事件是引起葡萄糖效應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力，包括13 種糖酵解酶中的6 種重復(fù)酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量的增加，這導(dǎo)致糖酵解通量增加[20-22]，而細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量有限，可以分配給新陳代謝的蛋白質(zhì)組的比例受到限制，所以糖酵解通量的增加和相關(guān)蛋白水平的提高是以犧牲呼吸系統(tǒng)蛋白為代價(jià)的，糖酵解途徑積累的NADH 只能通過(guò)快速生成副產(chǎn)物乙醇和甘油后再循環(huán)。調(diào)控細(xì)胞質(zhì)和線粒體的NADH水平能夠在一定程度上減輕葡萄糖效應(yīng)的影響，但是在分批培養(yǎng)過(guò)程中該方法并不能從根本上解決葡萄糖效應(yīng)，這可能是因?yàn)槠咸烟沁\(yùn)輸是糖酵解的主要通量控制步驟，是影響葡萄糖效應(yīng)的主要因素之一[21]。NOX 和AOX 表達(dá)菌株在分批培養(yǎng)中，從結(jié)果上能減少葡萄糖效應(yīng)形成的NADH，但是高葡萄糖運(yùn)輸這一主要因素不能控制，所以發(fā)酵途徑的蛋白翻譯不受影響，仍然有乙醇生產(chǎn)。葡萄糖效應(yīng)以犧牲其他蛋白的比例來(lái)增加糖酵解酶的現(xiàn)象，使得控制糖酵解通量應(yīng)該是解決葡萄糖效應(yīng)的重要策略，有文獻(xiàn)通過(guò)降低PYK 酶活性就達(dá)到了很好的葡萄糖效應(yīng)抑制結(jié)果[23-24]，但是大都以犧牲釀酒酵母生長(zhǎng)為代價(jià)。