王如意，范晶菁，李洪林，王 蕊

（華東理工大學藥學院, 上海市新藥設計重點實驗室, 上海 200237）

亨廷頓舞蹈癥（Huntington's disease, HD）作為神經(jīng)退行性疾病中最主要的單基因遺傳病，主要由基因突變引起[1]。其臨床癥狀表現(xiàn)為舞蹈癥、肌張力障礙、認知功能減退及抑郁等[1]。亨廷頓蛋白（Htt）參與囊泡轉運動力學、突觸傳遞和自噬調節(jié)等[2]，在神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎形成、神經(jīng)元存活和信號轉導等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，突變的Htt 蛋白（mHtt）誘導紋狀體神經(jīng)元損傷，導致神經(jīng)元丟失。神經(jīng)元的丟失使得紋狀體中多巴胺（DA）水平紊亂[3]，進而破壞大腦中所有神經(jīng)遞質的平衡，導致紋狀體功能障礙[4]，最終引起運動損傷[5]。3-硝基丙酸（3-NP）通過血腦屏障，結合并抑制線粒體上琥珀酸脫氫酶的催化位點，抑制三羧酸循環(huán)，從而選擇性損傷紋狀體神經(jīng)元，使動物表現(xiàn)出與HD 相似的病理改變和運動癥狀[6]。因此，3-NP 誘導的HD 大鼠模型被廣泛用于該疾病的研究。

丁苯那嗪（TBZ）是一種非典型抗精神病藥，具有降低單胺類神經(jīng)遞質的作用[7-8]，已被廣泛用于治療精神病、運動障礙以及中樞功能障礙等疾病[9-10]。據(jù)報道，TBZ 對舞蹈樣癥狀具有暫時的抑制作用[11]，然而，其對3-NP 誘導的HD 樣癥狀及病理改變的作用機制尚未完全揭示。

本文通過建立3-NP 誘導的HD 大鼠模型，證實了TBZ 可緩解3-NP 引起的大鼠體重下降和運動功能障礙，并著重研究了其改善舞蹈樣癥狀的機制。實驗結果表明，TBZ 通過降低囊泡單胺轉運體2（VMAT2）的表達和對突觸的保護作用調節(jié)DA 的突觸囊泡轉運過程，減少紋狀體中DA 的轉運和釋放。同時，TBZ 通過抑制酪氨酸羥化酶（TH）的表達降低DA 在紋狀體中的合成。通過上述兩種作用共同減少紋狀體中DA 水平，減少神經(jīng)元損傷，保護紋狀體正常功能，從而改善HD 樣癥狀。本文通過對TBZ 治療3-NP 誘導的HD 大鼠模型的藥效及機制研究，驗證了其治療HD 的可行性，研究結果為HD 的治療策略提供了新的方向。

1 實驗部分

1.1 試劑和藥物

3-NP（N5636-1G，純度≥97%）購自美國Sigma-Aldrich 公司，溶于生理鹽水中，用NaOH 調節(jié)pH 至7.4；TBZ（T2839-200MG，純度99%）購自日本TCL 公司；Htt 抗體和突觸素（SYN）抗體均購自美國Millipore公司；TH 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；VMAT2 抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國Proteintech 公司；免疫組化二抗試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒均購自武漢賽維爾有限公司；熒光二抗IgG、蛋白酶抑制劑和化學發(fā)光試劑盒（ECL）均購自Thermo Scientific 科技（中國）有限公司；DA 檢測試劑盒和HVA檢測試劑盒購自中國Cusabio 公司；尼氏染色試劑盒和苯甲基磺酰氟（PMSF）購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型建立 雄性Wistar 大鼠，200～300g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司。

將大鼠隨機分為3 組：生理鹽水組；3-NP組（注射劑量20mg/kg[12]）；3-NP+TBZ 組（3-NP、TBZ 注射劑量分別為20、3mg/kg[13]）。實驗流程如圖1 所示。預給藥1 周后，腹腔注射3-NP 或生理鹽水，連續(xù)5d。5d 后進行行為學測試。1.2.2 體重測量 每天在給藥前，于同一時間稱取大鼠的體重并記錄，按體重計算每日給藥量，取第1 d 和最后1 d 的體重計算其體重變化率。體重變化率（Δmw）計算公式如下：

圖1 實驗流程示意圖Fig.1 Experimental flow chart

其中，m'、m1分別為最后1 d 和第1 d 的體重。

1.2.3轉棒實驗 通過轉棒實驗測試大鼠的平衡能力。在實驗第12d 進行轉棒實驗，正式測試之前，所有大鼠接受為期3d 的訓練，轉棒轉速為4r/min，每天3 次，每次訓練3min。正式實驗中，轉棒從4r/min到20r/min 加速旋轉，記錄大鼠從轉棒上掉落的時間，重復3 次，取平均值用于比較分析。

1.2.4強迫游泳實驗 轉棒實驗結束后，將大鼠置于安靜的環(huán)境中休息3h，以消除對后續(xù)實驗的干擾。隨后進行強迫游泳實驗，將大鼠分別放入直徑25cm、水深30cm 的有機玻璃桶中，水溫為(25±3)℃，讓其游泳6min，記錄后5min 大鼠的不動時間。當動物停止掙扎，僅為了保持平衡或漂浮而運動時，就認為其處于不動狀態(tài)。

1.2.5Westernblot 實驗 大鼠處死后解剖、分離其紋狀體。在含有PMSF和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中裂解組織。提取后的蛋白用BCA 試劑盒進行蛋白定量。在100 V 電壓下，經(jīng)過φ=10%的分離膠分離，并轉膜至PVDF 膜上。封閉2 h 后，將條帶分別與Htt 抗體（體積比1∶1000）、TH 抗體（體積比1∶1000）或VMAT2 抗體（體積比1∶1000）于4 ℃下過夜孵育；洗膜，室溫下與GAPDH 抗體（體積比1∶10000）孵育2 h。通過化學發(fā)光檢測液顯色，于化學發(fā)光成像儀（Tanon 5200s 型）下曝光顯影。用ImageJ軟件對條帶進行定量。

1.2.6尼氏染色 大鼠麻醉后依次經(jīng)心臟灌注50mL生理鹽水和100mLφ=4%的多聚甲醛，分離腦組織保存于φ=4%的多聚甲醛中。酒精梯度脫水，石蠟包埋，以4μm厚度切片。切片脫蠟后于尼氏染色液中孵育10min，酒精梯度脫水，二甲苯脫色后用中性樹脂封片。

1.2.7免疫組化 石蠟切片脫蠟，于檸檬酸抗原修復液中熱修復，φ=3%的過氧化氫中孵育25min 以去除內源性過氧化物酶。切片于φ=5%山羊血清中封閉30min，加入Htt 抗體（體積比1∶1000）或TH 抗體（體積比1∶3000）于4℃條件下過夜孵育。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次后，將切片與生物素標記的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG 于37℃孵育1h。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）工作液進行顯色，觀察到陽性位置出現(xiàn)棕黃色后，用PBS 結束顯色。酒精梯度脫水后，浸入二甲苯中使其透明。稍晾干，中性樹脂封片。

1.2.8免疫熒光 一抗孵育前步驟與免疫組化相同，加入突觸素SYN 抗體（體積比1∶200）于4℃中避光過夜孵育。洗滌3 次，室溫下加入AlexaFluor?568山羊抗鼠（體積比1∶100）避光孵育2h。加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液孵育1min。PBS沖洗后，使用尼康共聚焦顯微鏡（Nikon-csu-w1sora型）觀察切片，設置激光波長為（405～561）nm。使用imageJ 軟件統(tǒng)計熒光強度。

1.2.9酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

（1）樣品制備 取適量紋狀體組織，PBS 沖洗血跡。加PBS 研磨至勻漿狀，于?20℃條件下放置過夜。反復凍融2 次以破壞細胞膜，在5000g，2～8℃條件下離心5min，分離上清。

（2）DA 水平檢測 用DA 檢測試劑盒檢測紋狀體中的DA 水平。加入標準品或樣品，于37℃孵育2h，棄液。每孔加入生物素標記抗體工作液，于37℃孵育1h，洗滌。每孔加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液，于37℃孵育1h，棄液，洗滌。依次加入底物溶液，于37℃避光孵育15～30min。加入終止液停止反應。用酶標儀于450nm 下測定各孔的光密度。使用BCA 試劑盒蛋白定量進行歸一化處理。

（3）HVA 水平檢測 用HVA 檢測試劑盒檢測紋狀體中HVA 水平。加入標準品或測試樣品，立即添加抗體工作液，于37 ℃孵育40 min。洗滌，加入酶結合物工作液，于37 ℃ 溫育30 min。洗滌，每孔加入底物溶液，于37 ℃避光顯色20 min。依次加入終止溶液終止反應。用酶標儀于450 nm 處測量各孔的光密度值。使用BCA 試劑盒蛋白定量進行歸一化處理。

1.2.10數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計 數(shù)據(jù)處理及作圖采用GraphPadPrism8.0，統(tǒng)計分析采用IBMSPSSStatistics 25，結果以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析進行組間差異性比較，其中“*”和“#”分別表示與模型組3-NP 和對照組相比；P<0.05 表示有顯著性差異；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；n表示每組樣本數(shù)。

2 結果與討論

2.1 TBZ 逆轉3-NP 誘導的體重減少和異常行為表現(xiàn)

體重和行為學變化被用來評估動物模型是否成功。結果表明，經(jīng)3-NP 誘導后，動物體重較對照組顯著下降（P<0.001，圖2（a）），這可能與代謝紊亂、神經(jīng)元變性以及雙側紋狀體損傷有關[14]，伴隨著體重下降會出現(xiàn)一些運動行為表型的改變[15-18]；在行為學實驗中，大鼠從轉棒上掉落的時間顯著減少（P<0.001，圖2（b）），在水中不動時間顯著增加（P<0.001，圖2（c）），表明運動能力受損，表現(xiàn)出HD 樣癥狀，這些變化可能與3-NP 損傷紋狀體功能有關[19]。與3-NP 單獨處理組相比，經(jīng)3-NP+TBZ（3 mg/kg,P<0.001）處理的大鼠從轉棒上掉落的時間顯著增加，且在桿上運動時四肢更有力，而3-NP 處理組動物則表現(xiàn)出跛行狀態(tài)。此外，TBZ 減少了動物在水中的不動時間 （P<0.001）。上述結果表明，TBZ 改善了大鼠的運動協(xié)調能力和游泳能力，表明TBZ 可以緩解3-NP 誘導的HD 樣癥狀。

圖2 TBZ 逆轉3-NP 誘導的體重減少和異常行為Fig.2 TBZ reversed 3-NP induced weight loss and abnormal behavior

2.2 TBZ 減輕3-NP 誘導的Htt 蛋白水平的升高

mHtt 蛋白在多種細胞中廣泛表達，可引起細胞毒性[20]，但HD 病變主要發(fā)生在紋狀體[21]。本研究通過Western blot 和免疫組化對動物紋狀體中Htt 的表達進行研究，結果如圖3 所示。與對照組相比，3-NP 處理組大鼠的紋狀體中Htt 水平顯著升高（P<0.05，圖3（a）、3（b）），這與HD 應有的病理特征相吻合。而TBZ 治療可以明顯逆轉Htt 水平的升高趨勢（P<0.01）。如圖3（c）顯示，紋狀體Htt 陽性信號呈棕黃色，與對照組相比，經(jīng)3-NP 誘導的大鼠紋狀體中陽性信號密度與強度均明顯增加，表明Htt 水平升高。而加入TBZ 可逆轉這一趨勢，提示TBZ 能降低Htt 的表達，該結果與Western blot 保持一致（圖3（c））。上述結果驗證了TBZ 可減輕3-NP 誘導的Htt 蛋白水平的升高。

圖3 TBZ 減輕3-NP 誘導的Htt 蛋白水平的升高Fig.3 TBZ reverses 3-NP-induced Htt protein upregulation

2.3 TBZ 提高3-NP 誘導的大鼠紋狀體和黑質中神經(jīng)元的存活

mHtt 可能引起興奮性谷氨酸中毒，并破壞附近神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞的功能，從而損傷神經(jīng)元[22]。為了驗證TBZ 對紋狀體神經(jīng)元的影響，采用尼氏染色法對大鼠紋狀體神經(jīng)元進行形態(tài)學分析并計數(shù)。如圖4 所示，對照組中神經(jīng)元形態(tài)正常且分布均勻，無明顯腫脹和核固縮。經(jīng)3-NP 誘導的大鼠紋狀體中神經(jīng)元數(shù)量較對照組減少（P<0.01），且神經(jīng)元分布不均，胞體呈現(xiàn)皺縮狀，且仁不清。經(jīng)TBZ 治療后，神經(jīng)元數(shù)量增加（P<0.01），形態(tài)趨于正常（圖4（a）、4（b））。mHtt 在疾病早期對紋狀體神經(jīng)元造成深度損傷，隨后影響大腦其他區(qū)域的神經(jīng)元[23-24]，因此，本研究進一步對黑質神經(jīng)元的損傷情況進行評估。與紋狀體相似，3-NP 處理組中大鼠黑質神經(jīng)元的數(shù)目明顯減少（P<0.01），而3-NP+TBZ 組中大鼠黑質神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加（P<0.05，圖4（c））。3-NP 引起神經(jīng)元丟失和死亡，而TBZ 可減輕3-NP 引起的神經(jīng)毒性，表明該化合物對3-NP 誘導的HD 大鼠模型具有神經(jīng)保護作用。

圖4 TBZ 提高3-NP 誘導的大鼠紋狀體和黑質中神經(jīng)元的存活Fig.4 TBZ improved 3-NP - induced neuronal survival in striatum and substantia nigra

2.4 TBZ 影響紋狀體中DA 及其代謝物的水平

紋狀體中神經(jīng)遞質水平的改變已被證明對HD的病理生理基礎和疾病的發(fā)展有重要貢獻[25-26]。本文采用ELISA 法測定動物紋狀體中DA 及其代謝物的濃度，驗證了TBZ 對神經(jīng)遞質水平的影響。如圖5(a)所示，3-NP 誘導的大鼠紋狀體中DA 水平顯著升高（P<0.05），而其代謝產(chǎn)物高香草酸（HVA）水平明顯下降 (圖5(b))，提示該動物模型中DA 及其代謝物水平紊亂，表明3-NP 處理組大鼠出現(xiàn)運動障礙可能與引起上述神經(jīng)遞質水平的改變有關。而TBZ處理的大鼠紋狀體中DA 水平（P<0.01）較模型組顯著下降，HVA 水平明顯升高（P<0.05），表明TBZ 可以逆轉3-NP 導致的紋狀體神經(jīng)遞質紊亂。這可能是TBZ 改善3-NP 誘導的HD 大鼠異常行為表型的原因之一。

圖5 TBZ 影響多巴胺及其代謝物的水平Fig.5 TBZ affects the levels of DA and its metabolite

2.5 TBZ 調節(jié)TH 的表達水平

采用Western blot 和免疫組化方法檢測紋狀體中TH 的表達水平。如圖6(a) 所示，紋狀體的TH 陽性信號為黑質DA 神經(jīng)元投射的神經(jīng)末梢，組化染色顯示各組均可見棕黃色陽性纖維。與對照組相比，注射3-NP 的大鼠紋狀體中TH 陽性纖維密度和信號強度均明顯升高。與此相反，TBZ 治療后紋狀體陽性纖維密度降低且信號減弱。統(tǒng)計分析結果顯示，3-NP 誘導的動物紋狀體中TH 水平高于對照組，但TBZ 處理組大鼠TH 水平顯著下降（P<0.01，圖6(b))。Western blot 的結果與上述結果一致(圖6(c))。因此，TBZ 可調節(jié)紋狀體中TH 的表達，使其恢復到正常水平。TH 是參與DA 合成的限速酶，抑制TH 可以大大降低DA 的生成[27-29]。TBZ 可能通過抑制紋狀體中TH 的表達來降低DA 及其代謝物的含量，從而影響運動表型。

2.6 TBZ 抑制3-NP 誘導的突觸損傷并調節(jié)VMAT2的表達水平

mHtt 對突觸功能具有明顯的毒性，如干擾突觸囊泡的運輸、破壞突觸囊泡的結構、抑制神經(jīng)遞質的攝取和釋放、影響突觸蛋白的表達或轉譯后修飾[30]。為了驗證TBZ 能否通過調節(jié)突觸囊泡影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質的正常釋放，本文研究了紋狀體中SYN 和VMAT2 的表達。采用免疫熒光法對大鼠紋狀體切片進行處理，采用共聚焦顯微鏡拍攝圖像（圖7（a））。圖7（b）表明3-NP 降低了大鼠紋狀體中SYN 水平（P<0.01），說明其對突觸具有損傷作用；而TBZ 逆轉了3-NP 對突觸的損傷（P<0.01），表明TBZ具有選擇性地結合并抑制VMAT2 的功能，可以減少囊泡對單胺類神經(jīng)遞質的作用[31]。由圖7（c）、7（d）可見，3-NP 處理組中動物紋狀體的VMAT2 水平顯著高于對照組（P<0.01），而TBZ 能改善這一異常現(xiàn)象（P<0.05），且其改變VMAT2 水平的趨勢與改變DA 水平趨勢保持一致，表明TBZ 可能通過調節(jié)VMAT2 水平影響紋狀體DA 的轉運和釋放。因此，TBZ 可能通過保護突觸水平及功能，并調節(jié)VMAT2蛋白的表達，恢復紋狀體中DA 的含量，其對DA 的調節(jié)作用進一步保護了神經(jīng)元，從而恢復紋狀體正常功能，最終緩解了3-NP 誘導的HD 樣癥狀，詳細機制過程見圖8。

圖7 TBZ 抑制3-NP 誘導的突觸損傷并調節(jié)VMAT2 的表達水平Fig.7 TBZ inhibited 3-NP induced synaptic damage and regulated VMAT2 expression

圖8 TBZ 改善HD 樣癥狀的機制示意圖Fig.8 Schematic diagram of mechanism of TBZ ameliorating HD-like symptoms

3 結 論

本文驗證了TBZ 對3-NP 誘導的HD 大鼠模型的治療作用，并證實TBZ 可以恢復該動物模型紋狀體中發(fā)生的DA 及其代謝產(chǎn)物HVA 水平的紊亂，以及降低VMAT2 的蛋白表達，保護突觸功能，進而減少單胺類神經(jīng)遞質的轉運和釋放，調節(jié)紋狀體中DA 的含量。此外，TBZ 還可以作用于DA 合成路徑中的合成限速酶TH，通過抑制該蛋白的表達減少DA 在紋狀體中的合成。這些作用共同導致TBZ 降低紋狀體中DA 水平，防止DA突觸后神經(jīng)元的過度刺激，減少紋狀體功能損傷，從而改善HD 樣癥狀。這可能為TBZ 治療HD 的機制提供了新的解釋。