張微 ，彭觀景，黃春，李青 ，黃云飛，李潔，周波 ，劉雅雯，李艷

1.湛江中心人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東湛江 524000；2.湛江中心人民醫(yī)院肝臟外科，廣東湛江 524000；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干診科，遼寧沈陽 110000

在正常人體內(nèi)，通過神經(jīng)、內(nèi)分泌等精細(xì)的調(diào)節(jié)，血糖會維持在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)，避免過度的波動，因為體內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)會隨著血糖的波動而逐漸增加，而且這種危害是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于持續(xù)性高血糖的[1]。眾多的研究證實血糖波動會導(dǎo)致糖尿病患者大血管和微血管發(fā)生病變的風(fēng)險以及死亡的危險顯著升高，并且已經(jīng)明確早期的病理生理改變基礎(chǔ)就是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[2-3]。乙酰半胱氨酸具有很強的粘液溶解作用，它作為祛痰劑已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用多年，無明顯不良反應(yīng)。近年來很多基礎(chǔ)實驗發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）具有顯著的抗氧化作用。2008年1月—2009年12月本研究選取雄性Wistar大鼠24只應(yīng)用間斷從靜脈輸注50%葡萄糖溶液的方式建立大鼠動物模型，同時加用抗氧化劑NAC干預(yù)，以便進一步探討NAC是否可以減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性清潔度Ⅰ級的Wistar大鼠24只購于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量280~330 g，隨機分為A組（對照組）、B組（急性血糖波動組）、C組（NAC干預(yù)組1）、D組（NAC干預(yù)組2），每組6只，應(yīng)用常規(guī)飼料及自由飲水[1]。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 ①NO、GSH-PX測定比色法檢測試劑盒從南京建成生物工程研究所購買。

②Elisa法檢測TNF-α、IL-6試劑盒購自晶美公司。

③應(yīng)用免疫組化方法檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)試劑盒及細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測試劑盒從武漢博士德公司購買。

1.2.2 建立動物模型 所有大鼠先經(jīng)過3~5 d的環(huán)境適應(yīng)，然后麻醉后行頸部動靜脈插管術(shù)，實驗中應(yīng)用動脈置管采血，靜脈置管輸液[4]。大鼠恢復(fù)3 d后開始輸液。

①對照組（A組），應(yīng)用0.9%生理鹽水，保持血糖在5.5 mol/L左右；②急性血糖波動組（B組），通過50%葡萄糖注射液的間斷輸注，保持血糖5.5~20.0 mmol/L；③NAC干預(yù)組1（C組），持續(xù)輸入NAC（0.35 mg/kg·min）及間斷50%葡萄糖注射液輸注，血糖保持在B組水平；④NAC干預(yù)組2（D組），持續(xù)輸入 NAC（0.7 mg/kg·min）及間斷50%葡萄糖注射液輸注，血糖保持在B組水平。輸液總共48 h。

1.2.3 標(biāo)本采集 輸液結(jié)束后，各組所有動物稱重，應(yīng)用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）通過腹腔注射麻醉動物，迅速分離主動脈，部分主動脈稱重后與預(yù)冷的生理鹽水以1:9的比例進行混合，應(yīng)用高速組織勻漿機在冰水浴中制成10%混懸液，4℃ 3 500 rpm離心10 min，取上清液-20℃冰箱保存以備檢測NO、GSH-PX、 TNF-α及IL-6。取部分組織制成蠟塊，連續(xù)切4 μm厚切片以備檢測iNOS的表達(dá)及凋亡。

1.3 觀察指標(biāo)

①血糖：采用葡萄糖氧化酶電極法。

②一氧化氮（nitric oxide，NO）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）：采用比色法。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）測定：采用Elisa(Enzyme linked immunosorbent assay)法。

③用免疫組化的方法測定主動脈內(nèi)iNOS的表達(dá)。

④應(yīng)用TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法檢測主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，分析方法為單因素方差分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間差異比較以t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX、NO、TNF-α、IL-6的比較

B組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX水平較A組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NO、TNF-α、IL-6水平較A組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），C組與D組和B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），C組與D組和A組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 4組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX、NO、TNF-α、IL-6水平比較(±s)

表1 4組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX、NO、TNF-α、IL-6水平比較(±s)

注：* 與A組比較P<0.05，#與B組比較P<0.05

組別A（n=6）B（n=6）C（n=6）D（n=6）GSH-PX(nmol/mgprot)10.02±1.10（6.26±0.38）*（9.89±1.06）#（9.20±1.91）#NO(μmol/L)1.11±0.14（2.83±0.48）*（1.24±0.15）#（1.16±0.18）#TNF-α(pg/mL)17.66±1.09（35.13±2.16）*（17.13±1.01）#（16.98±0.97）#IL-6 (pg/mL)9.82±0.61（20.56±3.78）*（9.33±0.55）#（9.27±0.49）#

2.2 4組大鼠主動脈勻漿中iNOS的比較結(jié)果

B組大鼠主動脈中iNOS相對表達(dá)量(0.41±0.05)較A組（0.14±0.03）明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），C組（0.15±0.01）與D組（0.16±0.03）和B組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），C組與D組和A組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1、圖2。

圖1 免疫組化檢測4組大鼠主動脈內(nèi)iNOS表達(dá)

圖2 4組大鼠主動脈勻漿中iNOS表達(dá)的比較

2.3 4組主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

B組在主動脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核中有棕黃色顆粒，在其余3組中未見細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖3 TUNEL檢測4組主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

3 討論

雖然大眾對糖尿病并不陌生，但是其實很多人并不是很了解該疾病的危害，即使是已經(jīng)確診糖尿病的患者，也是只關(guān)注于血糖的控制，殊不知，糖尿病更可怕的地方就是它的并發(fā)癥，比如糖尿病腎病、糖尿病足、大血管病變和微血管病變等等，而在這些并發(fā)癥中目前研究認(rèn)為心血管并發(fā)癥仍然是糖尿病患者主要的死亡原因[5-6]。從既往大量的研究中已經(jīng)確認(rèn)氧化應(yīng)激和炎癥是血管病變的重要原因和中心環(huán)節(jié)[7-8]。

目前人們已經(jīng)了解清楚血管病變的發(fā)生就是從血管內(nèi)皮損傷開始的，在以往的實驗中把內(nèi)皮細(xì)胞放到高糖環(huán)境中進行培養(yǎng)會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡，也就是內(nèi)皮損傷[9-10]。而且，血糖的濃度波動和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡都是息息相關(guān)的，血糖波動的危害大于持續(xù)的高血糖[1]。

人體內(nèi)部是一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在很多方面都需要保持一個平衡的狀態(tài)，如果人體內(nèi)的氧化物增多，抗氧化物減少，那么就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致組織的損傷[11]。血糖水平的升高可激活機體內(nèi)多元醇信號通路，從而消耗了機體內(nèi)大量的抗氧化物比如還原型谷胱甘肽，那么相對來說氧化物比如活性氧自由基就會積累增多，導(dǎo)致氧化與抗氧化之間失去平衡，這種不平衡進一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激，血糖水平升高還會使抗氧化酶糖基化GSH-PX活性降低。本研究發(fā)現(xiàn)在急性血糖波動組中GSH-PX的水平明顯降低提示存在氧化與抗氧化之間平衡失調(diào)，應(yīng)用抗氧化劑NAC后這種情況得到了改善，這種平衡的恢復(fù)也進一步證實了氧化應(yīng)激的存在。

在人體的酶系統(tǒng)中NOS系統(tǒng)是比較重要的，在這個系統(tǒng)中iNOS可以催化精氨酸脫氨基產(chǎn)生NO，NO的眾多作用當(dāng)中有一項很重要就是調(diào)節(jié)血管舒張，這種作用對維持心血管功能的穩(wěn)態(tài)也非常重要，它在體內(nèi)還會參與很多生理、病理的過程[12-13]。有研究對糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠進行比較會發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的iNOS活性明顯增加，本研究的發(fā)現(xiàn)也一樣，血糖波動使iNOS活性增強，NO水平也出現(xiàn)升高。

在眾多的炎癥因子中，TNF-α和IL-6是非常經(jīng)典也是非常重要的，如果檢測2型糖尿病患者的血清就會發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-6的水平是升高的，TNF-α和IL-6的作用非常廣泛，它可以促進機體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)自身免疫，還可以增加自由基，促進活性氧簇的增多，這種變化又和氧化應(yīng)激聯(lián)系起來，最終導(dǎo)致機體內(nèi)的線粒體功能紊亂[14]。TNF-α和IL-6還可以通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用這兩種方式影響內(nèi)皮功能。正如實驗結(jié)果所示應(yīng)用Ellisa法在急性血糖波動組檢測IL-6水平為（20.56±3.78）pg/mL，為本實驗4組中水平最高的，和其他3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對照組的水平只有（9.82±0.61）pg/mL，這和宋華靜等[15]的研究結(jié)果一致，宋華靜等研究血糖濃度波動對IL-6的影響時發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度波動組IL-6濃度的結(jié)果為(204.99±25.08)ρ/（ng·L），和對照組(122.41±18.19)ρ/（ng·L）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。同樣本實驗中TNF-α水平也明顯增加，可以認(rèn)為血糖波動誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，應(yīng)用抗氧化劑NAC后這種情況可以得到改善。

綜上所述，本研究成功建立了在體血糖波動的動物模型，并進一步研究證實血糖波動能增加主動脈內(nèi)皮內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激，應(yīng)用NAC后可以顯著改善炎癥和氧化應(yīng)激。從本研究中也看到了血糖波動尤其是急性血糖波動的危害，本研究也為改善血糖波動的危害提供了新的治療思路。