梁維鳳, 李子木, 常晶晶, 胡 繁

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

雙酚A(bisphenol A,BPA)是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì),廣泛應(yīng)用于合成聚碳酸酯以及環(huán)氧樹脂。作為食品包裝的重要單體原料,BPA可以通過物化遷移至食品內(nèi)容物中,從而進(jìn)入人體[1]。人類接觸BPA的途徑主要為飲食和環(huán)境,其中飲食暴露超過95%,環(huán)境暴露[2]低于5%。文獻(xiàn)[2-5]研究表明BPA暴露與不良健康有關(guān),例如低出生體質(zhì)量、癌癥、糖尿病、生殖問題、心血管疾病、肥胖和神經(jīng)性疾病等。因此,許多國(guó)家在一些食品包裝中禁止BPA的使用,這也刺激了工業(yè)上使用BPA的替代物進(jìn)行生產(chǎn),它們與BPA具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。據(jù)了解,目前一共有16種BPA替代物進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn),最主要的包含BPF[6]。其中BPA與雙酚F(bisphenol F,BPF)的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 雙酚A和雙酚F的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式

BPF也可以作為合成環(huán)氧樹脂的單體,并且可應(yīng)用于清漆、黏合劑、塑料、水管、牙科密封劑、食品包裝涂料等[7],其中在食品包裝中的應(yīng)用可能給人類健康帶來威脅。目前在地表水、沉積物以及室內(nèi)灰塵中均已發(fā)現(xiàn)了BPF的存在[6,8]。在對(duì)中國(guó)孕婦血清中的雙酚物質(zhì)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)BPF的檢出率[9]為20.4%,類似地,在來自西班牙女性乳汁中BPF的檢測(cè)水平[10]為22%,文獻(xiàn)[11]顯示在人類尿液中所檢測(cè)到BPF的濃度、頻率與BPA相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明,幼年期小鼠1 mg/(kg·d) BPA暴露會(huì)擾亂大腦突觸可塑性進(jìn)而影響嚙齒類動(dòng)物的行為[12],這一劑量遠(yuǎn)低于目前公認(rèn)最低觀察到BPA的不良反應(yīng)水平劑量50 mg/(kg·d),且低于未觀察到嚙齒類動(dòng)物全身不良反應(yīng)水平劑量[13]5 mg/(kg·d)。此外,根據(jù)人類與小鼠的體表面積藥理劑量換算,該劑量與人類在日常生活中暴露BPA的水平相當(dāng)[14]。作為BPA的主要替代物,盡管體內(nèi)與體外研究已表明BPF的毒性作用[15],然而目前關(guān)于BPF對(duì)大腦功能的影響研究并不多。本文利用行為學(xué)中經(jīng)典的行為學(xué)范式,觀察幼年期1 mg/(kg·d)BPF暴露對(duì)小鼠行為的影響,這將在工業(yè)生產(chǎn)中為BPA替代物的使用選擇提供理論依據(jù),并為在食品包裝領(lǐng)域BPF的添加標(biāo)準(zhǔn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

二甲基亞砜(DMSO)、BPF均購(gòu)于上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司;乙醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

曠場(chǎng)箱、懸尾箱、強(qiáng)迫游泳水桶以及三箱社交箱來源于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)動(dòng)物行為研究中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物的處理

12只C57BL/6J雄鼠(21 d)購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,其中對(duì)照組與BPF暴露組各6只,動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。為了模擬人類暴露BPF的途徑,本文選擇口服飲水的方式暴露BPF,將BPF先溶于DMSO中,再溶于水中,同時(shí)對(duì)照組小鼠飲用水中加入相同體積的DMSO。其中暴露劑量為1 mg/(kg·d),暴露時(shí)間為4周(21～49 d)。由于小鼠不斷成長(zhǎng),體質(zhì)量與飲水量也在不斷增加,因此藥物暴露期間每隔4 d稱量小鼠體質(zhì)量以及飲水量,及時(shí)更換水中BPF的濃度,給藥結(jié)束后第2天進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.3.2 曠場(chǎng)測(cè)試

曠場(chǎng)裝置是長(zhǎng)、寬、高分別為50、50、25 cm的白色無蓋長(zhǎng)方體,其中曠場(chǎng)底部被分為16個(gè)均等的小方格,中間4個(gè)小方格為中央?yún)^(qū)。將每只小鼠從相同位置放入曠場(chǎng)中,任其自由探索5 min,整個(gè)期間通過紅外攝像機(jī)記錄下來,且每只小鼠在測(cè)試前用75% 酒精擦拭箱體,以免上只小鼠的氣味造成干擾。后期使用EthoVision 8.5軟件分析小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的潛伏期、時(shí)間、頻率以及小鼠的運(yùn)動(dòng)總距離。

1.3.3 懸尾測(cè)試

在距離小鼠尾巴2 cm處使用膠帶將尾巴懸掛在懸尾箱的鉤子上(距離地面25 cm),由攝像機(jī)記錄6 min,后期使用雙盲法統(tǒng)計(jì)小鼠在后5 min內(nèi)的總靜止時(shí)間。

1.3.4 強(qiáng)迫游泳測(cè)試

強(qiáng)迫游泳裝置為直徑15 cm、高30 cm的無蓋玻璃圓柱體,其中水深15 cm,溫度保持在25 ℃左右。將小鼠單獨(dú)放入水中游泳6 min并通過攝像機(jī)記錄下來,后期使用雙盲法統(tǒng)計(jì)小鼠在后5 min內(nèi)小鼠的總靜止時(shí)間。且每只小鼠結(jié)束后換干凈的水以免前一只小鼠的排泄物、氣味等造成干擾。

1.3.5 三箱社交測(cè)試

三箱社交箱是長(zhǎng)、寬、高分別為60、40、25 cm的白色無蓋長(zhǎng)方體,且被分割成長(zhǎng)、寬、高分別為20、40、25 cm的3個(gè)均等隔間,小鼠可以自由穿入3個(gè)箱體。小鼠連續(xù)適應(yīng)社交箱3 d,第4天進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試分為2個(gè)階段:第1階段測(cè)試小鼠的社交能力,在三箱體的左箱體中放入1個(gè)金屬籠,右箱體對(duì)側(cè)放入1只同齡雄鼠(陌生鼠1)于相同的金屬籠中,將實(shí)驗(yàn)鼠放入中間箱體自由探索10 min;第2階段測(cè)試小鼠的社交新奇能力,將另一只同齡雄鼠(陌生鼠2)放于左箱體的金屬籠中,右箱體金屬籠中仍為陌生鼠1,任小鼠在三箱體中繼續(xù)探索10 min,整個(gè)測(cè)試階段用攝像機(jī)記錄下來,且每只小鼠測(cè)試前用75%酒精擦拭三箱體以免上只小鼠的氣味造成干擾。

使用EthoVision 8.5軟件分析小鼠在各個(gè)階段與空金屬籠、陌生鼠1、陌生鼠2的嗅探總時(shí)間。其中:社交指數(shù)為第1階段測(cè)試期間實(shí)驗(yàn)小鼠與陌生鼠1、金屬籠的嗅探時(shí)間之差比兩者之和;社交偏好指數(shù)為第2階段測(cè)試期間實(shí)驗(yàn)小鼠與陌生鼠1、陌生鼠2的嗅探時(shí)間之差比兩者之和。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Prism 5.0對(duì)所有行為數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,其中小鼠體質(zhì)量與飲水量選擇重復(fù)測(cè)量方差分析,數(shù)據(jù)均表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),其中:*表示P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;**表示P<0.01時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPF暴露對(duì)小鼠體質(zhì)量及飲水量的影響

小鼠在幼年期暴露BPF期間,每隔4 d稱取體質(zhì)量以及飲水量來觀察小鼠的生理狀態(tài),如圖2所示。由圖2a可知,幼年期BPF暴露組與對(duì)照組小鼠的成長(zhǎng)體質(zhì)量之間沒有差異;由圖2b可知,2組小鼠在幼年期藥物暴露期間的飲水量之間也沒有差異。結(jié)果表明,幼年期BPF暴露不會(huì)影響小鼠的生理狀態(tài)。

圖2 小鼠在BPF暴露期間的生理狀態(tài)變化

2.2 BPF暴露對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響

曠場(chǎng)測(cè)試是用來評(píng)估嚙齒類動(dòng)物“焦慮樣”行為以及基本運(yùn)動(dòng)能力的經(jīng)典行為范式,小鼠在曠場(chǎng)中的表現(xiàn)如圖3所示。

圖3 小鼠在曠場(chǎng)測(cè)試期間的行為表現(xiàn)

由圖3a可知,BPF暴露組小鼠在第1次進(jìn)入中央?yún)^(qū)的時(shí)間顯著高于對(duì)照組;由圖3b可知,BPF暴露組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的總時(shí)間顯著低于對(duì)照組;由圖3c可知,BPF暴露組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的總次數(shù)顯著低于對(duì)照組,即BPF組小鼠在中央?yún)^(qū)的活躍程度不高,表現(xiàn)出焦慮行為。此外,本文還分析了小鼠在曠場(chǎng)中的總運(yùn)動(dòng)距離,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3d所示。由圖3d可知,兩組小鼠之間沒有差異,即小鼠的基本運(yùn)動(dòng)狀況正常。結(jié)果表明,幼年期BPF暴露會(huì)誘導(dǎo)小鼠的焦慮情緒,且這種焦慮行為與小鼠的運(yùn)動(dòng)狀況無關(guān)。

2.3 BPF暴露對(duì)小鼠懸尾行為的影響

懸尾測(cè)試示意圖如圖4a所示,它是基于小鼠處于困境下,想要逃脫而又無法逃脫從而可能放棄掙扎,進(jìn)入一種抑郁不動(dòng)的狀態(tài),結(jié)果如圖4b所示。由圖4b可知,幼年期BPF暴露顯著增加小鼠在懸尾期間的靜止時(shí)間。

圖4 小鼠在懸尾測(cè)試期間的行為表現(xiàn)

2.4 BPF暴露對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳行為的影響

強(qiáng)迫游泳測(cè)試的示意圖如圖5a所示,其原理與懸尾測(cè)試的原理相同。

小鼠在強(qiáng)迫游泳的總靜止時(shí)間如圖5b所示,從圖5b可以看出,BPF暴露同樣會(huì)增加小鼠在強(qiáng)迫游泳期間的總靜止時(shí)間,這與懸尾的結(jié)果是一致的。結(jié)果表明幼年期BPF暴露會(huì)誘導(dǎo)小鼠的抑郁情緒。

圖5 小鼠在強(qiáng)迫游泳測(cè)試期間的行為表現(xiàn)

2.5 BPF暴露對(duì)小鼠三箱社交行為的影響

三箱社交測(cè)試第1階段用來評(píng)估小鼠的社會(huì)交往能力,小鼠在三箱社交測(cè)試期間的行為表現(xiàn)如圖6所示。

圖6 小鼠在三箱社交測(cè)試期間的行為表現(xiàn)

由圖6a可知,BPF暴露小鼠與陌生鼠1的嗅探時(shí)間顯著低于對(duì)照組,即BPF暴露組小鼠不愿意與陌生鼠交流。由于不同小鼠的活潑好動(dòng)程度不同,為了消除這種個(gè)體差異性,本文借鑒前人的分析方法分析小鼠的社交偏好指數(shù),分析結(jié)果如圖6b所示,該結(jié)果與嗅探時(shí)間分析的結(jié)果是一致的,即BPF暴露小鼠的社交偏好指數(shù)也顯著低于對(duì)照組。

三箱社交測(cè)試第2階段用來評(píng)估小鼠的社交偏好能力,即小鼠是否愿意與新的小鼠交流。從圖6c可以看出,BPF暴露組小鼠與陌上鼠2的嗅探時(shí)間與對(duì)照組相比沒有差異。

為了消除小鼠個(gè)體差異,本文分析了小鼠的社交新奇偏好指數(shù),如圖6d所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩組小鼠之間也沒有顯著差異。結(jié)果表明幼年期BPF暴露會(huì)損害小鼠的社交能力,而對(duì)社交新奇能力沒有影響,即小鼠的探索能力不會(huì)因BPF暴露而改變。

3 討 論

近年來,情緒障礙患者逐年增加,很多人把其歸因于工作和生活壓力,而忽略了源于飲食、環(huán)境等潛在危害。盡管大量研究已表明BPA的毒性作用且其已被限制使用,然而BPF作為BPA的主要替代物,它的研究仍未完全展開。此外,幼年期作為大腦發(fā)育關(guān)鍵期,盡管激素水平穩(wěn)定,但神經(jīng)系統(tǒng)仍易受到外界環(huán)境物質(zhì)的干擾[16]。因此,本文以幼年期為時(shí)間窗口,觀察BPF暴露對(duì)小鼠情緒以及社交行為的影響。

本文首先分析了小鼠在幼年期經(jīng)BPF暴露對(duì)其體質(zhì)量及飲水量的影響,結(jié)果表明BPF暴露不會(huì)影響小鼠的正常生理狀態(tài)。曠場(chǎng)測(cè)試結(jié)果顯示BPF暴露顯著減弱小鼠在中央?yún)^(qū)的活動(dòng)程度,誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生焦慮行為。這一結(jié)果與先前在圍產(chǎn)期[17]、青春期[18]以及成年期[19]暴露BPA對(duì)嚙齒類動(dòng)物的研究一致。文獻(xiàn)[20]研究表明尿液中BPA濃度與男孩的焦慮抑郁狀態(tài)呈正相關(guān)。然而,目前關(guān)于BPF對(duì)人類流行病學(xué)研究很少。抑郁癥以持續(xù)的情緒低落為主要癥狀,是目前世界上最常見的神經(jīng)性疾病之一。本文以懸尾和強(qiáng)迫游泳2種經(jīng)典的行為范式對(duì)BPF暴露小鼠進(jìn)行評(píng)估,行為結(jié)果表明兩者在小鼠處于困境下放棄掙扎、靜止不動(dòng)的時(shí)間是一致的,即BPF暴露誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抑郁行為。這與BPA的結(jié)果類似,且無論是對(duì)動(dòng)物還是人類的研究中,BPA誘導(dǎo)產(chǎn)生的異常情緒中焦慮與抑郁行為一般同時(shí)存在[16-19]。此外,文獻(xiàn)[21]發(fā)現(xiàn)在妊娠期通過口服暴露10 mg/(kg·d) BPF誘導(dǎo)子代小鼠的焦慮和抑郁行為,這與本文在幼年期以較低劑量暴露的結(jié)果是一致的。

社交是動(dòng)物本質(zhì)的內(nèi)在需求,是不同個(gè)體之間相互來往的社會(huì)活動(dòng)。焦慮抑郁狀態(tài)下可能伴隨著社交障礙,這些行為相關(guān)的腦區(qū)之間有重疊但不完全相同。為了評(píng)估BPF暴露對(duì)社交行為的影響,本文選擇經(jīng)典行為范式三箱社交。結(jié)果表明BPF暴露損害小鼠的社交能力而對(duì)社交新奇能力沒有影響。

文獻(xiàn)[22]研究發(fā)現(xiàn)BPA暴露影響4歲兒童的社交能力,且每當(dāng)BPA濃度增加2倍,社交溝通障礙增加11.8%。文獻(xiàn)[23]以小鼠為模型,發(fā)現(xiàn)BPA暴露引起小鼠社交缺陷,這與本文BPF暴露具有相似的結(jié)果。結(jié)果表明,BPF作為BPA的替代物,長(zhǎng)期暴露似乎與BPA具有相似的行為損傷,長(zhǎng)期BPF暴露對(duì)人類的潛在危害令人擔(dān)憂。

BPF與BPA暴露這種行為相似的結(jié)果與它們?cè)诖竽X中發(fā)揮的類雌激素作用有關(guān)。文獻(xiàn)[24]以斑馬魚為模型,研究了BPA及其替代物的雌激素活性,發(fā)現(xiàn)BPA的雌激素活性與BPF相當(dāng);文獻(xiàn)[25]報(bào)道BPF的雌激素活性高于BPA,這種結(jié)果的不一致性可能與雙酚物質(zhì)的暴露劑量和時(shí)期不同有關(guān);文獻(xiàn)[26]在妊娠期以10 μg/(kg·d) 暴露BPA、BPS以及BPF,發(fā)現(xiàn)雙酚物質(zhì)暴露組均降低大鼠前額葉皮層5α-還原酶的mRNA水平,影響多巴胺、5-羥色胺相關(guān)基因表達(dá)。情緒以及社交行為的表達(dá)受到來自大腦前額葉皮層的調(diào)控[27-28],而BPF暴露誘導(dǎo)小鼠行為的異常表達(dá)可能與前額葉功能發(fā)揮異常有關(guān)。未來將繼續(xù)探究雙酚物質(zhì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響及可能的生理機(jī)制,為工業(yè)上以雙酚物質(zhì)為原料的生產(chǎn),尤其是在食品包裝領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持。

4 結(jié) 論

本文研究發(fā)現(xiàn),幼年期1 mg/(kg·d) BPF暴露可誘導(dǎo)小鼠的焦慮行為、抑郁行為,減弱小鼠的社會(huì)交往能力,而對(duì)新奇小鼠的探索性以及小鼠本身的成長(zhǎng)生理狀態(tài)沒有影響。前額葉與杏仁核是調(diào)控情緒以及社交行為的關(guān)鍵腦區(qū),將進(jìn)一步探討B(tài)PF可能影響這些腦區(qū)功能的生理機(jī)制。此外,BPF作為BPA的主要替代物,在工業(yè)上的生產(chǎn)應(yīng)用仍需謹(jǐn)慎,且BPF對(duì)大腦發(fā)育關(guān)鍵期的毒性作用應(yīng)引起重視。