葉云芳, 丁 曼, 劉 詠, 王軍輝

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

秋葵(Abelmoschusesculentus(L.)Moench)又名黃秋葵、羊角豆,是錦葵科秋葵屬一年生草本開花植物,原產(chǎn)于非洲,現(xiàn)廣泛種植于亞洲、中東和歐洲的東南部等地區(qū)[1]。秋葵入藥歷史悠久,早在我國明代時期,李時珍在《本草綱目》中記載了秋葵的形態(tài)特征和藥用價值,言明秋葵的葉、花、根莖和種子都具有一定的藥用價值,可用來治療惡瘡、癰癤、脾虛乏力和腸燥便秘等病癥[2]。近些年對秋葵的研究發(fā)現(xiàn)秋葵嫩果莢富含多種營養(yǎng)物質(zhì),包括氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素以及黃酮類化合物等,其中多糖的含量尤為豐富,是秋葵中主要的活性成分[3-4]。據(jù)報道,秋葵多糖具有降血糖、抗疲勞、調(diào)節(jié)機體免疫機能及抑制腫瘤細胞生長等多種生物活性[5]。其優(yōu)良的生物活性吸引了國內(nèi)外研究學者的廣泛關(guān)注。20世紀60年代已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從秋葵嫩莢中獲得的水提多糖是由鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成的酸性多糖[6];秋葵水提多糖的結(jié)構(gòu)被證明主要由(1→2)連接的α-Rhap和(1→4)連接的α-GalpA組成,其中(1→4)連接的β-Galp側(cè)鏈部分連接到L-Rhap的O-4上[7]。目前,對秋葵嫩莢多糖的研究已逐漸趨于成熟,多集中在多糖的表征和功能特性等方面。

秋葵成熟后的果實逐漸木質(zhì)化,無法食用。木質(zhì)化秋葵是秋葵收獲種子后留下的副產(chǎn)物,但其卻占秋葵總質(zhì)量的50%以上,還富含大量的細胞壁多糖。但由于國內(nèi)外目前尚缺乏對木質(zhì)化秋葵的系統(tǒng)研究,造成木質(zhì)化秋葵的利用率較低,經(jīng)常被當作廢棄物扔掉。因此,為了尋找合適的處理方法,更好地利用木質(zhì)化秋葵這一豐富的農(nóng)作物資源,提取多糖是最佳的開發(fā)方法之一。本研究通過對木質(zhì)化秋葵進行多糖的提取純化,并對純化后的均一多糖進行理化性質(zhì)測定和結(jié)構(gòu)表征,研究結(jié)果為木質(zhì)化秋葵的開發(fā)利用提供可靠的數(shù)據(jù)及理論依據(jù),以促進木質(zhì)化秋葵的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

收獲了種子的木質(zhì)化秋葵果莢于2017年9月收集于安徽省鳳陽縣,自然曬干后經(jīng)高速中藥粉碎機粉碎,于烘箱中進一步干燥至恒重。利用95%乙醇浸泡干燥的木質(zhì)化秋葵果莢粗粉3 d以脫色脫脂,風干后保存?zhèn)溆谩?/p>

DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂購于北京索來寶公司;單糖標準品和葡聚糖標準品購于美國Sigma公司;三氯乙酸(光譜級)購于Aladdin;其余試劑(分析純)均購于中國國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

高速中藥粉碎機(達微機械,濟南);高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific,美國);紫外可見分光光度計(菁華科技儀器,上海);傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared,FTIR)光譜儀(Thermo公司,美國);高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)(Waters公司,美國);氣相色譜儀(gas chromatograph,GC)(Agilent 公司,美國);核磁共振儀(Agilent公司,美國)。

1.3 木質(zhì)化秋葵多糖的分離純化

稱取脫色脫脂后的木質(zhì)化秋葵粗粉100 g,以1∶30的料液比在100 ℃下提取2 h,提取2次。合并2次提取液,在60 ℃下減壓蒸發(fā),將提取液濃縮至原來體積的1/10,以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min去除不溶物。利用Sevag試劑[8](V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=1∶4)對糖液進行脫蛋白處理,分液漏斗上層溶液減壓濃縮去除未反應的三氯甲烷或正丁醇后,用自來水和蒸餾水分別透析72、48 h。透析液濃縮離心凍干即得木質(zhì)化秋葵粗多糖。

稱取木質(zhì)化秋葵粗多糖500 mg溶解于500 mL蒸餾水中,在電動攪拌器快速攪拌的條件下緩慢加入95%乙醇,使得糖液的最終乙醇體積分數(shù)為40%。將其在4 ℃冰箱中冷藏過夜后,以8 000 r/min離心10 min,合并沉淀溶解于蒸餾水中,透析冷凍干燥后得到的組分即為40%醇沉組分AP1。

稱取40%醇沉組分AP1(120 mg)溶解于10 mL超純水中,以8 000 r/min離心后,吸取上清液緩慢加入到DEAE-Cellulose陰離子交換層析柱中(3.0 cm×40.0 cm),以0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液依次對AP1進行洗脫,得到4個純化組分,分別命名為AP1-a、AP1-b、AP1-c、AP1-d。

1.4 木質(zhì)化秋葵均一多糖的理化性質(zhì)測定

1.4.1 總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸質(zhì)量分數(shù)的測定

以D-Glc為標準品,用苯酚-硫酸法[9]測定總糖質(zhì)量分數(shù);以牛血清白蛋白為標準品,采用考馬斯亮藍法[10]測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù);用硫酸-咔唑法[11]測定糖醛酸質(zhì)量分數(shù),用半乳糖醛酸作標準曲線。

1.4.2 分子量和均一性的測定

用雙蒸水配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的多糖溶液,通過0.22 μm過濾器過濾后備用。使用高效液相色譜系統(tǒng)、2424蒸發(fā)光散射檢測器以及TSK凝膠柱G4000PWXL(7.8 mm×300.0 mm)與G5000PWXL(7.8 mm×300.0 mm)的串聯(lián)線性柱對多糖的均一性和分子量進行檢測。將一系列標準葡聚糖(T-10、T-40、T-70、T-500)按峰時間和相對分子質(zhì)量的對數(shù)繪制標準曲線。參照上述制備的標準曲線計算多糖分子量[12]。

1.4.3 紫外吸收光譜表征

將木質(zhì)化秋葵均一多糖配制成1 mg/mL的溶液,于紫外可見光譜儀上在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描[13]。

1.5 木質(zhì)化秋葵均一多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 單糖組成

采用GC對多糖的單糖組成進行分析[12]。純化后的多糖組分(10 mg)在110 ℃下用2 mL三氟乙酸溶液(TFA)水聚4 h,水解產(chǎn)物在室溫下用NaBH4還原3 h后,加入25%乙酸溶液終止反應。利用吡啶和乙酸酐對樣品進行乙?；幚?將樣品轉(zhuǎn)化為醛醇乙酸酯。采用HP-5毛細管柱(0.25 μm×320 μm×30 μm)和氣相色譜系統(tǒng)(Agilent Technologies)對獲得的醛醇乙酸酯進行分析。柱烘箱初始溫度為150 ℃,升溫過程設(shè)定為10 ℃/min升溫至200 ℃,4 ℃/min升溫至270 ℃。N2流速為20 mL/min,以鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)為單糖標準品分析樣品的單糖組成。

1.5.2 FTIR表征

使用Perkin-Elmer分光光度計(Spectrum 100,Perkin-Elmer,Waltham,MA,USA)在4 000～500 cm-1的掃描范圍內(nèi)記錄樣品的FTIR光譜[14]。

1.5.3 部分酸水解分析

將50 mg多糖溶解于0.5 mol/L三氟乙酸溶液(8 mL),并在100 ℃下水解1 h。將水解產(chǎn)物在超純水中透析48 h后濃縮冷凍干燥,即得到多糖的部分酸水解組分[14],利用GC對其進行進一步分析。

1.5.4 甲基化分析

將30 mg真空干燥的木質(zhì)化秋葵多糖溶解于5 mL無水二甲基亞砜中,在N2保護下快速加入2 mL制備好的甲基亞磺酰甲基鈉試劑并攪拌0.5 h,使其充分溶解。在避光和冰浴條件下,緩慢加入2 mL CH3I試劑,在50 ℃的油浴鍋中攪拌1 h后室溫下攪拌過夜。將反應物透析冷凍干燥即可得到甲基化的多糖。取少量多糖樣品進行紅外光譜檢測,若3 500 cm-1處的羥基峰完全消失可證明多糖甲基化完全[15];反之,應對多糖進行重復甲基化處理,直至甲基化完全。根據(jù)文獻[16]方法,利用88%甲酸在100 ℃對甲基化樣品進行解聚處理,并參照上述單糖組成分析方法對解聚產(chǎn)物進行衍生化。采用配備有DB-5毛細管柱的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)進行分析。

1.5.5 核磁共振光譜表征

稱取50 mg多糖,溶于99.9%的重水(D2O)中,于核磁共振儀中在60 ℃下進行核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR)、核磁共振碳譜(13C nuclear magnetic resonance,13C-NMR)、異核單量子相干譜(heteronculear single quantum coherence,HSQC)和1H的異核多碳相關(guān)譜 (1H detected heteronuclear multiple bond correlation,HMBC)波譜分析[14]。

2 實驗結(jié)果

2.1 木質(zhì)化秋葵多糖的均一性分析

木質(zhì)化秋葵粗多糖經(jīng)40%乙醇醇沉后獲得醇沉組分AP1,AP1經(jīng)DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂分離純化得到4個純化組分,分別命名為AP1-a、AP1-b、AP1-c、AP1-d,如圖1所示。

圖1 多糖AP1-c的DEAE-Cellulose洗脫曲線

多糖AP1-c的HPLC分析結(jié)果如圖2所示,從圖2可以看出,均一性測定AP1-c為均一多糖組分,因此以下研究均集中研究多糖AP1-c,根據(jù)葡聚糖標準曲線計算出AP1-c的分子量為658 kDa。

圖2 多糖AP1-c的HPLC譜圖

2.2 木質(zhì)化秋葵均一多糖的理化指標分析

通過苯酚硫酸法、咔唑硫酸法和考馬斯亮藍法測得AP1-c的總糖質(zhì)量分數(shù)為95.36%,糖醛酸質(zhì)量分數(shù)為24.83%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為0.72%。

2.3 單糖組成分析

利用GC測定單糖、AP1-c及其部分水解產(chǎn)物的組成,結(jié)果如圖3所示。

圖3 單糖、AP1-c及其部分酸水解組分的GC譜圖

通過與圖3a的單糖標準品(Rha、Xyl、Ara、Man、Glc、Gal)進行對比,可以確定AP1-c組分主要由半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)和葡萄糖(Glc)組成,其摩爾比為1.85∶1.00∶0.24∶0.67。

為了進一步了解多糖AP1-c的主鏈和支鏈組成,對其進行部分酸水解處理。AP1-c的部分酸水解產(chǎn)物的GC譜圖如圖3c所示,由圖3c可知,其單糖組成為Gal、Rha、Glc、Ara,摩爾比為0.55∶1.00∶0.11∶0.04。與AP1-c相比,部分酸水解產(chǎn)物的Gal相對含量急速下降,Glc和Ara的相對含量下降至痕量,而Rha的相對含量基本保持不變。由于多糖經(jīng)三氟乙酸水解時,位于支鏈的多糖殘基更易被水解[14],因此部分酸水解后的AP1-c的支鏈被全部或部分去除。由此推測Rha和部分Gal殘基可能位于主鏈上,而支鏈可能含有Glc、Ara和Gal。

2.4 紫外光譜表征結(jié)果分析

經(jīng)TU-1901型紫外可見分光光度計測得AP1-c的紫外光譜,如圖4所示。

圖4 多糖AP1-c的紫外光譜圖

從圖4可以看出,在紫外光譜的260 nm或者280 nm處均沒有吸收峰,說明AP1-c多糖中基本不含有核酸或者蛋白質(zhì)[17]。與考馬斯亮藍法測得的結(jié)果一致。

2.5 FTIR表征結(jié)果分析

多糖AP1-c的FTIR譜圖如圖5所示。由圖5可知,在3 418 cm-1處的強而寬的吸收峰主要是由于多糖分子間或分子內(nèi)氫鍵中的O—H的拉伸振動引起的[18];2 937 cm-1的弱吸收峰歸因于甲基或亞甲基的C—H的伸縮振動[17];大約在1 609 cm-1處的信號是由脫質(zhì)子羧基(COO—)的拉伸振動引起的[19];1 426 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是由C—H鍵的彎曲振動引起的[14];1 042 cm-1處的吸收峰表明多糖中存在吡喃糖環(huán)[20];而896 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰表明AP1-c中存在β型糖苷鍵[20]。

圖5 多糖AP1-c的FTIR譜圖

2.6 甲基化分析結(jié)果

多糖AP1-c經(jīng)完全甲基化、水解、還原和乙酰化處理后經(jīng)GC-MS分析,所得結(jié)果與GC-MS數(shù)據(jù)庫中標準物質(zhì)質(zhì)譜圖進行比對,結(jié)果見表1所列。GC-MS分析結(jié)果表明,組成AP1-c糖鏈的糖殘基連接方式共有5種,分別為1,3,4-linked-Rhap、1-linked-Araf、1,4-linked-Galp、1-linked-Galp、1,6-linked-Glcp,對應的摩爾比為2.9∶1.6∶2.7∶2.3∶0.7。

表1 AP1-c的甲基化分析

2.7 核磁共振光譜分析

核磁共振光譜是定性分析各種有機物、無機物的化學成分和結(jié)構(gòu)的不可或缺的工具之一,其在多糖的結(jié)構(gòu)解析中起著舉足輕重的作用。多糖AP1-c的核磁共振光譜如圖6所示。

從圖6可以看出,多糖的1H-NMR主要用來鑒別多糖結(jié)構(gòu)中的α或β構(gòu)型。在1H-NMR中,異頭氫的信號為4.8×10-6～5.5×10-6,其他C-2～C-6的質(zhì)子信號[21]均集中在4.0×10-6～4.8×10-6。

圖6 多糖AP1-c的核磁共振光譜

從圖6a可以看出,AP1-c的異頭氫范圍內(nèi)信號峰的化學位移δ位于5.13×10-6、 5.19×10-6、4.89×10-6、4.49×10-6、4.98×10-6,分別歸屬于→3,4)-α-D-Rhap-(1→(A)、α-L-Araf-(1→(B)、→4)-β-D-Galp-(1→(C)、β-D-Galp-(1→(D)、→6)-β-D-Glcp-(1→(E)糖殘基的異頭氫。13C-NMR的化學位移除了可以確定各類碳的位置,還能區(qū)別分子的構(gòu)型和構(gòu)象[22]。從圖6b可以看出,δ位于98.32×10-6、98.31×10-6、97.41×10-6、103.36×10-6、97.69×10-6處的信號分別歸屬于→3,4)-α-D-Rhap-(1→、α-L-Araf-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→、β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Glcp-(1→的異頭碳。各糖殘基的其他位的化學位移見表2所列。

表2 AP1-c糖殘基的化學位移 10-6

二維核磁共振圖譜的分辨率高,包含大量信息,一般與一維圖譜以及甲基化和部分酸水解等結(jié)合起來分析多糖中糖殘基的連接方式。AP1-c的HSQC和HMBC圖譜如圖6c、圖6d所示。從圖6c可以看出,多糖AP1-c各糖殘基的異頭碳和異頭氫之間的交叉峰的化學位移A1 (5.13/98.32)、B1(5.19/98.31)、C1(4.89/97.41)、D1(4.49/103.36)、E1(4.98/97.69)。從圖6d可看出,糖殘基連接順序中碳氫遠程耦合的相關(guān)峰[23]。結(jié)合AP1-c的甲基化和部分酸水解的分析結(jié)果以及參考文獻推斷,AP1-c的主鏈是由→3,4)-α-D-Rhap-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→組成,而支鏈則是α-L-Araf-(1→、β-D-Glcp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→通過→4)-α-D-Rhap-(1→的O-3位連接在主鏈上。相應地,HMBC的交叉峰EH1/A C3 (4.98/76.80)表明E糖殘基的1位連接在A糖殘基的3位上,交叉峰AH1/CC4(5.13/76.84)表明殘基A的H-1位連接在殘基C的C-4位上,以及交叉峰BH1/AC3 (5.19/76.80)則表明B糖殘基的H-1與A糖殘基的C-3相連。

3 結(jié) 論

本文以木質(zhì)化秋葵脫色、脫脂和脫蛋白純化后獲得的水提醇沉均一多糖AP1-c為對象,對其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進行研究。理化性質(zhì)結(jié)果表明AP1-c的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)分別為95.36%、24.83%、0.72%。紫外光譜在260、280 nm處均沒有吸收峰,表明AP1-c基本不含有核酸與蛋白質(zhì),與理化性質(zhì)測定結(jié)果一致。運用甲基化、HPLC、GC、GC-MS及核磁共振光譜儀等化學和儀器方法共同表征AP1-c的結(jié)構(gòu),結(jié)果表明AP1-c的主鏈是由→3,4)-α-D-Rhap-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→組成,而支鏈則是α-L-Araf-(1→、β-D-Glcp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→通過→4)-α-D-Rhap-(1→的O-3位連接在主鏈上。本文定性分析了木質(zhì)化秋葵多糖的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征,研究結(jié)果為開發(fā)木質(zhì)化秋葵資源提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論支持。