陳金鳳,鹿孟云,劉華彬,祝嫦巍*

(1.安徽科技學院 農(nóng)學院,安徽 鳳陽 233100;2.安徽科技學院 生命與健康科學學院,安徽 鳳陽 233100)

紫杉醇是一種從紅豆杉屬植物中提取的具有特殊結(jié)構(gòu)的二萜類生物堿[1],可以與微管結(jié)合并使其穩(wěn)定不解聚,從而導致細胞的生理活動異常,誘導細胞凋亡,是目前治療卵巢癌、乳腺癌的首選藥物,并且對白血病、肺癌、直腸癌以及其他一些實體瘤等均有很好的療效,且其不良反應(yīng)相對較小[2],臨床應(yīng)用范圍廣、前景大。

紫杉醇最早從紅豆杉的樹皮中直接提取,紅豆杉中紫杉醇含量僅為0.015%,生產(chǎn)1 kg紫杉醇需要2 000～2 500棵成年的紅豆杉樹木[3],產(chǎn)量低,價格高。紅豆杉樹生長緩慢,野生紅豆杉已被列為瀕危的珍稀保護植物[4]。因此探索其他生產(chǎn)紫杉醇的方法,以解決紫杉醇原料藥的來源問題成為近年的研究熱點。Das等[5]從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)中分離到一株能獨立合成紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomycesandreanae),為解決紫杉醇原料藥的來源提供了新的思路和途徑。隨后,國內(nèi)外學者紛紛開展紫杉醇內(nèi)生真菌的分離工作,不僅從紅豆杉及其近緣植物中發(fā)現(xiàn)了紫杉醇內(nèi)生真菌,還從非紅豆杉屬植物中分離到了可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌[6-8]。產(chǎn)紫杉醇真菌在自然界中廣泛存在,且具有較高的多樣性。

雖然真菌產(chǎn)紫杉醇提供了一種可能的生產(chǎn)途徑,但目前報道的菌株產(chǎn)量均較低,無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此除了新菌株的分離鑒定,人們也通過大量的工作對已有菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以期提高產(chǎn)量進而達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。Xu等[9]通過優(yōu)化氮源、微量元素等培養(yǎng)基組分,將Fusariummaire的紫杉醇產(chǎn)量提高至225.2 μg/L,提高約1.31倍。苗莉云等[10]通過優(yōu)化各種培養(yǎng)條件,包括培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間等,將枝狀枝孢霉MD2的紫杉醇產(chǎn)量提高至569.5 μg/L,約為初始值的3.4倍。目前是在培養(yǎng)基中添加前體物或誘導子來提高真菌紫杉醇的產(chǎn)量。喬廣軍等[11]向培養(yǎng)基中加入20 mg/L苯丙氨酸、10 mg/L乙酸銨、5 mg/L酪氨酸、20 mg/L甘氨酸時,紫杉醇產(chǎn)量顯著提高,達到547 μg/L,比初始產(chǎn)量高337%。茍莉等[12]報道,在液體培養(yǎng)基中加入20 mg/L苯丙氨酸、30 mg/L苯甲酸鈉、8 g/L乙酸鈉、15 mg/L甘氨酸、0.05 mg/L CuSO4、6 mmol/L H2O2、15 mg/L 3,5-二硝基水楊酸時能有效提高紫杉醇產(chǎn)量,比優(yōu)化前增產(chǎn)46.64%。目前雖然有較多研究,但由于菌株特性的差異以及實驗者所采用的策略不同,不同前體物或誘導子的影響差異較大。

本試驗對一株產(chǎn)紫杉醇真菌JM-25進行研究,通過在液體培養(yǎng)基中添加氨基酸,探討氨基酸的種類、添加時間以及添加量對紫杉醇合成的影響,為后期的發(fā)酵生產(chǎn)和工業(yè)化制備紫杉醇奠定基礎(chǔ),也為紫杉醇合成途徑的理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 真菌JM-25,安徽科技學院生物綜合實驗中心實驗室分離保存。

1.1.2 試劑 紫杉醇標準品(北京索萊寶科技有限公司);纈氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,甲硫氨酸,丙氨酸,脯氨酸,絲氨酸,酪氨酸,谷氨酸,蘇氨酸,甘氨酸,半胱氨酸,天冬酰胺,賴氨酸,谷氨酰胺,天門冬氨酸,精氨酸,組氨酸(AR,上海麥克林生化科技有限公司);葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂、二氯甲烷(AR,西隴科學股份有限公司);甲醇(色譜純,西隴科學股份有限公司)。

1.1.3 儀器 LQ-A10002電子天平(瑞安市安特稱重設(shè)備有限公司);Agilent1260高效液相色譜儀(美國Agilent科技公司);HPX-9082MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HZ500L型雙門雙層全自動恒溫搖床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責任公司);XD52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海賢德實驗儀器有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：200 g去皮馬鈴薯、20.0 g葡萄糖、1.5 g硫酸鎂、3.0 g磷酸二氫鉀、15.0～20.0 g瓊脂、1 000 mL水,pH自然,121 ℃,高壓蒸汽滅菌20 min。PDB液體培養(yǎng)基：不添加瓊脂,其他成分與PDA相同。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng) 菌種首先在PDA固體培養(yǎng)基上活化。在無菌條件下,將固體培養(yǎng)基上的菌種切成小塊,接入裝有100 mL PDB液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中,每個搖瓶中接入約四分之一平板的菌種量,26 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d,作為種子液。將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液均質(zhì),以5%的量接種接于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,26 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 生物量的測定 發(fā)酵液離心,收集菌絲,置于50 ℃烘干至恒重,稱量菌體質(zhì)量。

1.2.3 紫杉醇的提取 將每瓶樣品加入50 mL二氯甲烷,置于搖床上振蕩過夜,充分萃取。收集下層有機相,于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干,用2 mL的無水甲醇溶解干燥物,0.22 μm的微孔過濾器過濾后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 紫杉醇產(chǎn)量的測定 采用高效液相色譜(HPLC)法檢測。色譜條件：色譜柱為Agilent 5 HC-C18(2)色譜柱,流動相為甲醇∶水(V/V)=75∶25,柱溫為25 ℃,波長為227 nm,流速為0.500 mL/min,進樣量為20 μL,用紫杉醇標準品做對照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有樣品一式3份,試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對菌株生物量及其紫杉醇產(chǎn)量的影響

在液體培養(yǎng)條件下,菌株JM-25的生物量積累及紫杉醇產(chǎn)量結(jié)果分別如圖1～2。21 d的培養(yǎng)過程中,每3天取樣1次,測定菌株的生物量及發(fā)酵液中的紫杉醇產(chǎn)量。如圖1所示,隨著培養(yǎng)時間的延長,生物量逐漸積累,在培養(yǎng)至第15天獲得最大生物量11.25 g/L。

圖1 培養(yǎng)時間對菌株JM-25生物量的影響Fig.1 Effects of culture time on biomass of strain JM-25

紫杉醇產(chǎn)量在培養(yǎng)第9天時達到最大值(145.93 μg/L),之后略有波動,但隨培養(yǎng)時間延長,紫杉醇產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢(圖2)。綜合考慮菌絲生長、紫杉醇產(chǎn)量、時間等因素,以下試驗均為7 d培養(yǎng)的結(jié)果。

圖2 培養(yǎng)時間對菌株JM-25合成紫杉醇的影響Fig.2 Effects of culture time on the paclitaxel yield of strain JM-25

2.2 不同種類的氨基酸對紫杉醇產(chǎn)量的影響

常見的20種氨基酸可以分為非極性氨基酸和極性氨基酸,極性氨基酸又可以分為帶電荷和不帶電荷的氨基酸。在培養(yǎng)基中添加終濃度為1 mmol/L的氨基酸,對菌株JM-25發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的影響如圖3所示,添加8種非極性氨基酸均對JM-25的紫杉醇產(chǎn)量有一定的提高作用,其中苯丙氨酸對紫杉醇的產(chǎn)量影響最大,產(chǎn)量達到了314.1 μg/L,約為對照的2.04倍。添加亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸也分別獲得269.6、240.8、217.6 μg/L紫杉醇產(chǎn)量。極性不帶電氨基酸對JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響如圖4所示,其中添加酪氨酸對JM-25的紫杉醇產(chǎn)量影響最大,平均產(chǎn)量為315.1 μg/L,比對照提高了2.05倍。極性帶電氨基酸對JM-25的紫杉醇產(chǎn)量沒有明顯的促進作用,相反,添加賴氨酸和精氨酸還表現(xiàn)出一定的抑制作用(圖5)。

圖3 非極性氨基酸對菌株JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of nonpolar amino acids on the paclitaxel yield of strain JM-25

圖4 極性不帶電氨基酸對菌株JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of polar non-charged amino acids on the paclitaxel yield of strain JM-25

圖5 極性帶電氨基酸對菌株JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of polar charged amino acids on the paclitaxel yield of strain JM-25

2.3 氨基酸濃度對紫杉醇產(chǎn)量的影響

根據(jù)不同種類氨基酸對產(chǎn)量的影響,篩選出了對JM-25的紫杉醇產(chǎn)量影響較大的酪氨酸和苯丙氨酸,進一步探討添加不同濃度的酪氨酸和苯丙氨酸對JM-25的紫杉醇產(chǎn)量的影響。如圖6～7所示,隨著培養(yǎng)基中氨基酸濃度的增加,紫杉醇的產(chǎn)量也逐漸增加,酪氨酸和苯丙氨酸均在終濃度1.5 mmol/L時產(chǎn)量較高,分別是355.4 μg/L和348.7 μg/L,較對照提高了2.40倍和2.35倍。但添加終濃度1.5 mmol/L與2 mmol/L之間基本沒有差異,添加酪氨酸和苯丙氨酸的變化趨勢也基本無差異。

圖6 不同濃度酪氨酸對JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of tyrosine concentration on the paclitaxel yield of strain JM-25

圖7 不同濃度苯丙氨酸對JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of phenylalanine concentration on the paclitaxel yield of strain JM-25

2.4 不同添加時間對紫杉醇產(chǎn)量的影響

在不同的培養(yǎng)時間添加終濃度1.5 mmol/L的酪氨酸和苯丙氨酸對產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖8～9所示。隨著添加時間的后延,酪氨酸和苯丙氨酸對JM-25紫杉醇產(chǎn)量的促進作用呈現(xiàn)上升趨勢。在培養(yǎng)0、2、4、6 d添加酪氨酸,分別獲得251.8、276.0、480.2、607.3 μg/L紫杉醇,為對照組的1.81、1.99、3.46、4.37倍;添加苯丙氨酸分別獲得240.8、406.8、431.3、453.5 μg/L的產(chǎn)量,為對照組的1.73、2.93、3.11、3.26倍。

圖8 酪氨酸添加時間對JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of tyrosine addition time on the paclitaxel yield of strain JM-25

圖9 苯丙氨酸添加時間對JM-25紫杉醇產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of phenylalanine addition time on the paclitaxel yield of strain JM-25

3 結(jié)論與討論

本研究探討在液體培養(yǎng)條件下,添加氨基酸對菌株JM-25產(chǎn)紫杉醇的影響。結(jié)果顯示,在培養(yǎng)基中添加酪氨酸和苯丙氨酸對紫杉醇合成的促進作用最大,在培養(yǎng)第6天添加終濃度為1.5 mmol/L的氨基酸,第7天收獲,獲得最大產(chǎn)量607.3 μg/L(添加酪氨酸)和453.5 μg/L(添加苯丙氨酸)。

在液體培養(yǎng)條件下,大多數(shù)氨基酸對紫杉醇的合成具有促進作用,只有少數(shù)如精氨酸、賴氨酸對紫杉醇的合成有抑制作用。20種氨基酸根據(jù)側(cè)鏈上R基團的不同,分為極性和非極性氨基酸,從本試驗結(jié)果看,對紫杉醇合成的影響與R基團的性質(zhì)沒有關(guān)系,因為酪氨酸屬于極性氨基酸,而苯丙氨酸屬于非極性氨基酸。從目前已知的紫杉醇合成途徑分析[13-15],苯丙氨酸從1個側(cè)鏈反應(yīng)參與紫杉醇的合成。結(jié)構(gòu)式上看,酪氨酸與苯丙氨酸都具有1個苯環(huán)結(jié)構(gòu),也是區(qū)別于其他氨基酸的重要特征,因此推測可能是二者促進紫杉醇合成的原因,即為紫杉醇合成提供前體物。

在前期的篩選中,亮氨酸和異亮氨酸也具有較好的促進作用,也是值得關(guān)注的影響因子,但目前沒有更多的數(shù)據(jù)證明其作用原理,各種試驗仍在進一步探討中。