肖 兵,黃家夢(mèng),陸曉民

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽 鳳陽(yáng) 233100)

鎘(Cd)是最常見(jiàn)的重金屬之一,對(duì)植物和動(dòng)物等生物體具有劇毒,很容易被植物根系從土壤中吸收,然后進(jìn)入食物鏈,對(duì)動(dòng)物和人類健康構(gòu)成潛在威脅[1-2]。針對(duì)鎘污染的土壤,主要有物理、化學(xué)和微生物修復(fù)方法,相比之下,微生物修復(fù)是一種更環(huán)保、更具成本效益的方法[3-4]。

在自然界中,植物被大量的微生物定殖,其中土壤微生物在維持植物健康、生產(chǎn)力調(diào)節(jié)、激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)、幫助宿主植物適應(yīng)有害環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用[5-6]。微生物介導(dǎo)的植物激素狀態(tài)變化主要是與乙烯等揮發(fā)性化合物的形成有關(guān)[7-8]。由于很難監(jiān)測(cè)水稻內(nèi)生菌的生理狀態(tài),所以水稻內(nèi)生菌對(duì)植物抑制鎘吸收的機(jī)制尚不清楚。該研究報(bào)道了水稻內(nèi)生菌Pseudomonassp.LP20對(duì)水稻鎘吸收的影響,進(jìn)一步探討了該菌株提高水稻抗鎘能力的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻品種 日本晴(OryzaSativaL.spp.japonica)由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 水稻培養(yǎng)和菌種分離鑒定 使用2.5% NaClO溶液對(duì)水稻種子表面消毒15 min,然后用無(wú)菌水沖洗5次。將滅菌后的種子置于黑暗條件下3 d,然后移至無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液(1.43 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、1.43 mmol/L (NH4)2SO4、2.14 mmol/L CaCl2、1.34 mmol/L KH2PO4、1.02 mmol/L K2SO4、1.65 mmol/L MgSO4·7H2O、0.10 mmol/L Na2SiO3·9H2O、9.10 μmol/L MnCl2·4H2O、0.52 μmol/L(NH4)6MO7O24·4H2O、18.5 μmol/L H3BO3、0.15 μmol/L ZnSO4·7H2O、0.16 μmol/L CuSO4·5H2O、35.8 μmol/L EDTA-Fe)。水培試驗(yàn)在30 ℃/22 ℃(白天/夜晚)生長(zhǎng)室中進(jìn)行,光照和暗光周期分別為16、8 h。

在鎘脅迫的土壤(50 mg/kg Cd)中種植水稻,分離細(xì)菌菌株。取約1.0 g根樣品用2.5% NaClO溶液消毒10 min,用無(wú)菌水研磨,并在含有100 μmol/L CdCl2的LB瓊脂平板上培養(yǎng)36 h。通過(guò)16S rRNA基因?qū)Ρ葴y(cè)序?qū)?xì)菌鑒定。為研究耐鎘細(xì)菌對(duì)水稻植物鎘脅迫的抗性影響,LP20最初在含有5.0 g/L NaCl、5.0 g/L酵母提取物和10.0 g/L胰蛋白胨培養(yǎng)。隨后將細(xì)菌懸浮液轉(zhuǎn)移到含有和不含80 μmol/L CdCl2無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液的水培箱中。每個(gè)盒子16株幼苗,分為4種處理：野生型、含LP20(-Cd+LP20)、含鎘(+Cd)以及裝有鎘和LP20 (+Cd+LP20)的盒子,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 葉綠素含量和乙烯測(cè)定 取0.5 g新鮮葉子浸入20 mL 80%丙酮中,室溫避光保存24 h,將提取液以12 000 r/min離心10 min,測(cè)定葉綠素含量[9]。將水稻根轉(zhuǎn)移到裝有1 mL無(wú)菌水的10 mL玻璃瓶中,立即密封,在黑暗條件下30 ℃培養(yǎng)5 h,然后將1 mL空氣體注入氣相色譜儀(Focus GC,Thermo,United States)分析乙烯含量。根據(jù)根樣品的鮮重(FW)計(jì)算乙烯的總量[10]。

1.2.3 水稻鎘含量測(cè)定 用無(wú)菌去離子水、5 mmol/L CaCl2和5 mmol/L EDTA對(duì)莖和根樣品連續(xù)沖洗,80 ℃下烘干24 h。將0.5 g植物組織用HNO3-HClO4(體積比為4∶1)混合液180 ℃下消化3 h,用原子吸收光譜儀檢測(cè)植物組織中的鎘濃度。

1.2.4 ACC脫氨酶活性篩選 LP20在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,以8 000 r/min離心10 min。洗滌沉淀物并重新懸浮在無(wú)菌水中。將細(xì)菌懸浮液稀釋并在3 mmol/L ACC代替(NH4)2SO4的ADF培養(yǎng)基上培養(yǎng)。28 ℃下培養(yǎng)3 d,生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落為產(chǎn)ACC脫氨酶的細(xì)菌[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pseudomonas sp.LP20對(duì)水稻鎘抗性的影響

在Pseudomonassp.LP20處理的情況下,將10日齡的水稻幼苗移植到含有80 μmol/L CdCl2的營(yíng)養(yǎng)液。結(jié)果顯示,LP20對(duì)非鎘脅迫下水稻生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響,而接種LP20對(duì)鎘脅迫水稻植株的鮮重和株高明顯高于未接種植株。同時(shí)發(fā)現(xiàn)鎘脅迫條件下水稻植株的葉綠素含量顯著降低,而接種LP20植株的葉綠素含量保持相對(duì)較高(圖1)。為進(jìn)一步探究,在鎘脅迫處理2周后分析水稻鎘含量變化,發(fā)現(xiàn)水稻植株的莖和根中鎘含量顯著增加,而接種LP20的水稻植株的莖和根部鎘含量顯著降低(圖2)。

圖1 LP20對(duì)水稻鎘脅迫下生物量的影響Fig.1 Effects of LP20 on biomass of rice under stress

圖2 LP20對(duì)水稻鎘含量的影響Fig.2 Effects of LP20 on cadmium content in rice

2.2 Pseudomonas sp.LP20對(duì)乙烯生物合成的影響

乙烯可以激活水稻植物中鐵吸收相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因的高水平表達(dá)會(huì)增強(qiáng)鎘的吸收,從而加劇鎘的毒性,因此LP20誘導(dǎo)水稻對(duì)鎘的抗性可能是由于乙烯生物合成受到抑制進(jìn)而影響植株鎘的吸收。接種LP20用80 μmol/L CdCl2處理10日齡水稻幼苗3 d ,發(fā)現(xiàn)與未處理的水稻相比,鎘處理的水稻根系乙烯水平顯著增加,而LP20接種植物的根部乙烯含量明顯低于未接種植物(圖3A)。為進(jìn)一步研究在3 mmol/L ACC作為唯一氮源的ADF培養(yǎng)基中檢測(cè)LP20的ACC脫氨酶活性,結(jié)果顯示菌株不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng),說(shuō)明LP20不能產(chǎn)生ACC脫氨酶。為了證實(shí)乙烯參與LP20誘導(dǎo)水稻鎘抗性的假設(shè),檢測(cè)了LP20對(duì)用乙烯生物合成前體ACC(50 μmol/L)處理的水稻植株鎘積累的影響。如圖3所示,ACC處理后植株生物量、株高和葉綠素含量顯著降低,說(shuō)明ACC消除了LP20緩解水稻植株鎘毒性的作用。

2.3 LP20對(duì)葡萄糖醛酸分泌的影響

經(jīng)HPLC分析,在LP20的細(xì)菌培養(yǎng)物中葡萄糖醛酸(GA)的含量隨時(shí)間逐漸增加(圖4A),表明LP20是一種產(chǎn)生葡萄糖醛酸的細(xì)菌。與對(duì)照組相比,鎘脅迫條件下,接種LP20的根積累的葡萄糖醛酸水平顯著高于對(duì)照組(圖4B)。

圖4 LP20對(duì)葡萄糖醛酸分泌的影響Fig.4 Effects of LP20 on glucuronic acid secretion

2.4 葡萄糖醛酸對(duì)水稻鎘脅迫的影響

如圖5所示,葡萄糖醛酸處理顯著提高了水稻植株對(duì)鎘的抗性,鮮重和葉綠素含量顯著增加,水稻植物的莖葉和根部鎘含量顯著低于對(duì)照組。同時(shí)也可以觀察到葡萄糖醛酸誘導(dǎo)的水稻植株對(duì)鎘的抗性在很大程度上被ACC削弱,相反乙烯生物合成抑制劑AVG增強(qiáng)了水稻植株對(duì)鎘脅迫的抗性。

圖5 葡萄糖醛酸對(duì)植物鎘脅迫響應(yīng)的影響Fig.5 Effects of glucuronic acid on plant response to cadmium stress

3 結(jié)論與討論

重金屬污染在農(nóng)田中普遍存在,嚴(yán)重威脅著食品安全。由于土壤凈化的難度和成本較高,迫切需要制定低價(jià)環(huán)保的方法來(lái)處理農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的重金屬污染[12]。該研究驗(yàn)證了內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)激素平衡來(lái)限制植物對(duì)鎘的吸收。發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫條件下接種Pseudomonassp.LP20水稻植株的鮮重和株高明顯高于未接種植株,水稻植株的葉綠素含量顯著降低,而接種LP20植株的葉綠素含量保持相對(duì)較高。

大量文獻(xiàn)表明乙烯對(duì)植物緩解重金屬毒害有重要作用,其中微生物通過(guò)增加或降解植物激素含量途徑越來(lái)越受到人們關(guān)注[13-14]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),接種內(nèi)生菌LP20植物的根部乙烯含量明顯低于未接種植物,ACC處理后水稻植株生物量、株高和葉綠素含量顯著降低,說(shuō)明ACC消除了LP20緩解水稻植株鎘毒害的作用。然而用內(nèi)生菌LP20產(chǎn)生的葡萄糖醛酸(GA)處理植株發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果,植株鮮重和葉綠素含量顯著增加,莖和根部鎘含量低于對(duì)照組。同時(shí)也可以觀察到葡萄糖醛酸誘導(dǎo)的水稻植株對(duì)鎘的抗性在很大程度上被ACC削弱,相反乙烯生物合成抑制劑AVG處理卻增強(qiáng)了水稻植株對(duì)鎘脅迫的抗性。

綜上,內(nèi)生菌LP20通過(guò)分泌葡萄糖醛酸抑制乙烯生物合成從而減少水稻根系中鎘的積累。