俞麗云,胡能兵*,陳績峰,張雅庭,郭紅艷,鄧蓮玉,張雪平

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;2.南京天香菊生物技術(shù)有限公司,江蘇 南京 210000)

串葉松香草(SilphiumL.)是菊科(Compositae)松香草屬(Silphium)多年生宿根草本植物。目前,對串葉松香草的研究主要集中在栽培技術(shù)、飼喂效果、藥用價值等方面[1]。串葉松香草具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、耐高溫、耐寒、耐鹽堿、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等特點,是一種新型飼草綠肥作物,是多種家畜、家禽和魚配合飼料及蛋白質(zhì)補(bǔ)充飼料的重要成分[2]。此外,串葉松香草也是水土保持、防風(fēng)固沙、退耕還草和生態(tài)環(huán)境建設(shè)的首選草種[3-4]。串葉松香草中還含有大量的生物堿、核黃素、黃酮類和甙類物質(zhì)[5-7]。從其根莖提取的芳香焦?fàn)钣陀信d奮和抗痙攣、養(yǎng)生的功效,可用作強(qiáng)壯劑和補(bǔ)劑,也可用于發(fā)燒、內(nèi)傷、虛弱、潰瘍及肝虛、脾虛等治療,同時也是藥酒、藥用乳膠的有效成分[8]。

多倍體育種具有多目標(biāo)性狀的綜合改良效果,如植株在生產(chǎn)中表現(xiàn)出來的營養(yǎng)器官和生殖器官增大、營養(yǎng)成分增多、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等特征[9-10],對新品種選育具有重大意義。目前通過秋水仙素誘導(dǎo)植株多倍體成功的報道較多,張丞慧等[11]研究發(fā)現(xiàn)0.05%的秋水仙素處理幼苗1 d能取得較好的誘導(dǎo)效果;李良良等[12]用100 mg/L秋水仙素處理“紅陽”獼猴桃愈傷組織5 h變異率達(dá)到23.97%;張曉曼等[13]通過誘導(dǎo)田埂報春獲得花大、色艷、植株低矮緊湊的四倍體植株;王真等[14]對半枝蓮的種子、莖尖生長點和根尖生長點進(jìn)行誘變處理,均得到多倍體植株。

將植物組織培養(yǎng)與化學(xué)誘變技術(shù)相結(jié)合是開展無性繁殖作物誘導(dǎo)育種的重要方法[15-18]。本研究在建立離體培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上,采用秋水仙素浸泡法篩選最佳誘導(dǎo)串葉松香草多倍體的濃度和處理時間,以期建立高效的串葉松香草多倍體誘導(dǎo)體系,創(chuàng)新種質(zhì)資源為后期育種利用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為串葉松香草二倍體種子,由南京天香菊生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 串葉松香草植株再生和多倍體誘導(dǎo)試驗方法

1.2.1 育苗 將當(dāng)年采收的串葉松香草的成熟種子,用洗衣粉水洗滌種子表面,流水沖洗30 min,放入超凈工作臺中紫外處理30 min;浸泡在75%乙醇2 min后;用0.1% HgCl2溶液浸泡,振蕩(150 r/min,28 ℃)培養(yǎng)3 min,用無菌水滌蕩種子5次,用濾紙吸收種子表面水分并浸泡20 h。接入已滅菌的MS培養(yǎng)基內(nèi),培養(yǎng)14 d。

1.2.2 離體生長點誘導(dǎo)植株再生 將基質(zhì)瓶內(nèi)培養(yǎng)14 d的苗用無菌水清洗4～5遍,僅保留生長點位置,分別轉(zhuǎn)接在再生培養(yǎng)基上,MS培養(yǎng)基內(nèi)添加8 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖,pH為6.0,每種培養(yǎng)基16個生長點,3次重復(fù),暗培養(yǎng)14 d后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)。光照時間為14 h/d,光照強(qiáng)度為3 000 lx,培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃,36 d統(tǒng)計不定芽增殖情況。

1.2.3 離體植株生根培養(yǎng) 將分化出的組培苗作為外植體材料,以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,采用3種同一濃度不同類型的激素作生根培養(yǎng)基,培養(yǎng)基內(nèi)添加8 g/L瓊脂以及30 g/L蔗糖,pH為6.0,每種培養(yǎng)基15個生長點,3次重復(fù),暗培養(yǎng)14 d后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)。其他培養(yǎng)條件同離體生長點誘導(dǎo)植株再生,20 d統(tǒng)計植株生根情況。

1.2.4 秋水仙素誘導(dǎo)處理 用離體再生外植體的生長點位置,篩選出外植體在不同誘導(dǎo)時間(6、12、24 h)和不同誘導(dǎo)劑處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.02%、0.05%、0.1%)的最理想誘導(dǎo)方案,使用搖床振蕩處理(150 r/min,28 ℃),將各處理的外植體用無菌水沖洗4～5遍,繼代到最適增殖培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)并觀察其生長狀況。

1.2.5 移栽 以秋水仙素加倍處理生根后的組培苗來完成煉苗試驗,當(dāng)組培苗苗長4 cm、根長4 cm時,移至育秧盤內(nèi),煉苗3 d后移到盆內(nèi),煉苗45 d后分別對成苗的葉片進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察和對根尖染色體數(shù)目觀察。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和葉綠體觀察 用鑷子撕取一小塊葉片,下表皮朝上制片,用OLYMPUS生物顯微鏡(40×)觀測串葉松香草不同倍性的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和葉綠體數(shù)目,每個葉片統(tǒng)計5個視野的氣孔數(shù)目,取平均值作為氣孔密度,測量5個氣孔的長度、寬度以及葉綠體的個數(shù),重復(fù)3次。

1.3.2 葉片厚度測量 選取新鮮葉片,平放在載玻片上,用刀片切取寬為0.5 cm中央帶有主脈的長方形小塊葉片。每個葉片切割3次成薄的葉片,制片,用OLYMPUS生物顯微鏡觀察葉片厚度,重復(fù)3次,取平均值。

1.3.3 根尖染色體數(shù)觀察 每個植株剪取3個1.5 cm秋水仙素處理后串葉松香草的根尖,將解離完成的根尖用無菌水漂洗,用改良的苯酚品紅溶液染色,常規(guī)壓片,重復(fù)3次。選取染色體分散、清晰的細(xì)胞,使用OLYMPUS生物顯微鏡觀察染色體條數(shù),對照為二倍體(2n=2x=14)。

1.3.4 聚類分析 從串葉松香草下表皮的保衛(wèi)細(xì)胞長、保衛(wèi)細(xì)胞寬、氣孔密度、葉綠體數(shù)目及葉片厚度等進(jìn)行聚類分析。

1.3.5.數(shù)據(jù)處理 用Microsoft Excel整理試驗數(shù)據(jù),用DPS 9.05進(jìn)行相關(guān)性和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對串葉松香草離體生長點再生的影響

將種子接種至已滅菌的基質(zhì)中,待生長14 d后,將剪下的生長點接種于T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9培養(yǎng)基上進(jìn)行再生培養(yǎng),15 d后外植體的基部和底部開始分化成芽,36 d基部和底部的芽分化成壯苗。經(jīng)Duncan多重比較結(jié)果表明,9種培養(yǎng)基之間差異呈顯著水平,T2增殖系數(shù)為5.5,為最佳分化培養(yǎng)基(表1)。植物的不同組織和器官都有可能作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗,但培養(yǎng)效果存在差異[19-21]。李先芳等[22]以串葉松香草幼葉葉柄、子葉和胚軸作為外植體,通過愈傷組織分化成苗。史向遠(yuǎn)等[23]研究以串葉松香草新生生長點易誘導(dǎo)成芽,所以本研究以新生生長點為外植體。結(jié)合圖1可看出,添加TDZ,前期分化能力強(qiáng),但易形成愈傷,不利于后期分化成芽,而添加6-BA的效果顯著優(yōu)于添加KT和TDZ的效果,苗壯且從芽生長旺盛,可以判斷6-BA在串葉松香草的分化成芽中起著關(guān)鍵作用。

圖1 串葉松香草離體再生Fig.1 In vitro regeneration of Cup Plant

表1 不同培養(yǎng)基對生長點離體再生的影響Table 1 Effect of different media on the regeneration of growth points in vitro

2.2 不同類型激素對串葉松香草生根的影響

待組培苗長至4 cm時,轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基內(nèi),組培苗基部第8天開始出現(xiàn)米白色突起,有根原基發(fā)生(圖2),20 d時外植體生根率最高可達(dá)80%以上。方差分析結(jié)果表明,CSG1與CSG2和CSG3之間差異顯著且CSG1的生根率最高平均為89.0%,其為最佳生根培養(yǎng)基。從表2可知,CSG1根長,根壯,側(cè)根分生多,地上部生長良好,其平均根長為4.2 cm左右,根系生活力強(qiáng);CSG2愈傷生根,根壯,根長,地上部生長一般;CSG3愈傷生根,根短,地上部生長弱。其中CSG1和CSG2的幼苗移栽成活困難。

表2 不同培養(yǎng)基對串葉松香草生根的影響Table 2 Effect of different media on rooting of Cup Plant

圖2 串葉松香草生根(CSG1)Fig.2 Rooted Cup Plant

2.3 秋水仙素濃度和處理時間對串葉松香草再生植株誘導(dǎo)的影響

通過人工誘導(dǎo)多倍體是創(chuàng)建植物新種質(zhì)的重要途徑之一,同時也是一種重要的植物育種手段[24-25]。在植物多倍體離體誘導(dǎo)中,不同植物材料的不同部位所采用的秋水仙素的最佳處理方式、處理時間以及處理濃度,需要根據(jù)大量的試驗數(shù)據(jù)分析來確定[26-29]。經(jīng)過離體培養(yǎng)誘導(dǎo)的多倍體可用于生藥材使用或直接栽培研究,同時植物在多倍化后一般都會呈現(xiàn)巨大型,其內(nèi)在的有效成分可能隨著染色體的增加而產(chǎn)生變化,為研究多倍體串葉松香草的內(nèi)在有效成分提供了一定的基礎(chǔ)[30]。

由表3可以看出,秋水仙素在不同處理濃度和不同處理時間下,增殖系數(shù)隨著濃度的升高和時間的增加開始減少,且死亡的外植體數(shù)逐步升高。當(dāng)處理濃度為0.02%,搖床處理時間為24 h,外植體材料致死率達(dá)到90%;當(dāng)秋水仙素處理濃度達(dá)0.2%,搖床處理時間為6 h,致死率達(dá)50%,且增殖系數(shù)為2.50左右。

表3 秋水仙素不同濃度和處理時間對串葉松香草生長點再生的影響Table 3 Effects of different colchicine concentrations and treatment times on the regeneration of growth points of Cup Plant

2.4 不同倍性植株組培苗細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

本研究先通過形態(tài)學(xué)觀察法,但從這單一性狀來分析過于片面,故再采用表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞法,通過觀察比較二倍體和四倍體葉綠體數(shù)量(圖3),后者葉綠體數(shù)量顯著增加,可以對四倍體材料進(jìn)行初步鑒定。

圖3 串葉松香草二倍體(左)和四倍體(右)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體比較Fig.3 Comparison of chloroplasts in guard cells of diploid (left) and tetraploid (right) of Cup Plant

采用浸泡法處理組培苗并使其生根,共出苗262株,移栽后成活210株,成活率達(dá)80.2%,通過細(xì)胞學(xué)鑒定觀察,結(jié)合表4可以看出,四倍體部分材料的保衛(wèi)細(xì)胞長和寬顯著大于二倍體,但四倍體的氣孔密度減小。由于串葉松香草無明確的品種,每個單株之間的株高形態(tài)差異較大,故僅對串葉松香草的葉片厚度進(jìn)行測量。由表4可知,四倍體材料與二倍體材料的葉片厚度差異不顯著。目前,根據(jù)串葉松香草內(nèi)的保衛(wèi)細(xì)胞長、氣孔密度、葉綠體數(shù)目以及葉片厚度等差異分析可以初步判定有15份多倍體材料,但若要確定其倍性還需進(jìn)一步進(jìn)行根尖染色體的倍性鑒定。

表4 二倍體及多倍體串葉松香草的葉片厚度與表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞特征比較Table 4 Comparison of leaf thickness and epidermal stomatal guard cell characteristics in diploid and polyploid Cup Plant

2.5 根尖染色體數(shù)比較

通過細(xì)胞顯微鏡對根尖染色體數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)觀察,結(jié)果表明,串葉松香草二倍體植株的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=2x=14(圖4A);使用OLYMPUS生物顯微鏡觀察染色體條數(shù),鑒定其染色體數(shù)目為2n=4x=28(圖4B),進(jìn)一步確定15份變異植株為串葉松香草四倍體植株。由此可判定根尖染色體數(shù)目觀察鑒定結(jié)果與細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果一致,所以誘導(dǎo)率可達(dá)7.14%,但部分四倍體植株從外觀形態(tài)方面也未展現(xiàn)出巨大性,原因需尚待研究。

圖4 串葉松香草二倍體(A)和四倍體(B)根尖染色體Fig.4 Diploid (A) and tetraploid (B) root tip chromosomes of Cup Plant

2.6 不同倍性植株組培苗細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)的聚類分析

由于串葉松香草屬于異花授粉且雜合的植物,且串葉松香草無明確的品種,每個單株之間差異較大,故不僅二倍體植株與四倍體植株之間顯著差異,四倍體植株的細(xì)胞和形態(tài)之間也存在差異,因此分別對16份串葉松香草的二倍體和四倍體的細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(圖5),聚類樹形圖直觀的反應(yīng)了不同資源在葉片上細(xì)胞形態(tài)特征上的相似性。

圖5 串葉松香草細(xì)胞形態(tài)學(xué)聚類Fig.5 Cytomorphological clustering of Cup Plant

在歐式距離5.27處作等級結(jié)合線可將16份資源分成4大類,分別為CK、JC1、JC2、JC3。將CK單獨聚類,37、72分為JC1類,53、137、56、128、79、185、100分為JC2類,110、123、154、174、210、201分為JC3類,其中CK類為二倍體,JC1、JC2和JC3類為四倍體。由表5可看出,在保衛(wèi)細(xì)胞長中,JC1類和JC3類分別顯著高于CK和JC2,但二倍體CK與四倍體JC2無顯著差異。而在保衛(wèi)細(xì)胞寬內(nèi),JC2類顯著高于其他3類,可以判斷四倍體葉片在保衛(wèi)細(xì)胞的寬上無明顯加倍現(xiàn)象。CK類的氣孔密度顯著高于四倍體JC1、JC2、JC3類。從葉綠體數(shù)目可以看出四倍體JC1類、JC2類、JC3類顯著高于二倍體植株,結(jié)合圖3可看出串葉松香草植株加倍后,其葉綠體數(shù)目明顯增加。JC1、JC3類的葉片厚度顯著大于JC2類、JC2類的葉片厚度顯著大于CK類。

表5 串葉松香草細(xì)胞形態(tài)學(xué)聚類分析Table 5 Clustering analysis of the cell morphology of Cup Plant

3 結(jié)論與討論

本研究獲得串葉松香草組培快繁最適的增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA,以及最適的生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基不添加任何外源激素。在建立組培體系基礎(chǔ)上,以0.2%秋水仙素浸泡處理6 h作為誘導(dǎo)串葉松香草多倍體最佳處理濃度和時間,誘導(dǎo)率可達(dá)7.14%。

目前,多倍體鑒定方法主要有形態(tài)鑒定法、細(xì)胞學(xué)鑒定法、分子標(biāo)記鑒定法、染色體計數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測法等[31-33]。最常用的鑒定方法為流式細(xì)胞術(shù)檢測和染色體計數(shù),可以簡化鑒定步驟和降低鑒定成本,另外多倍體植物一般“巨大性”表現(xiàn)明顯[34-36],故先通過表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞法和形態(tài)觀察法,再進(jìn)行根尖染色體數(shù)觀察,不僅簡化了誘導(dǎo)的技術(shù)環(huán)節(jié),還成功獲得串葉松香草的15份同源四倍體新材料,為串葉松香草創(chuàng)新種質(zhì)資源,提高育種價值。針對串葉松香草本身品種的差異,對二倍體與四倍體植株以及四倍體植株之間進(jìn)行聚類分析,為以后的優(yōu)良品種篩選和鑒定給予一定的技術(shù)支撐。