姜曉彤，王義敏，何元龍，秦永彪，朱傳才,潘維善

（山東華農(nóng)生物制藥有限公司，山東 臨朐 262600）

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的禽類下痢、呼吸道感染和敗血癥等多種臨床表現(xiàn)的疾病。較常見的癥狀有心包炎、肝周炎、腹膜炎、輸卵管炎、氣囊炎等[1]。隨著禽規(guī)?；B(yǎng)殖的迅速發(fā)展，致病性大腸桿菌對養(yǎng)禽業(yè)造成的損失日趨增加[2]。長期以來大腸桿菌病主要依賴抗生素進行防控，但抗生素的長期濫用導(dǎo)致禽大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性不斷增強，耐藥譜不斷擴大，增加了臨床防控難度[3]。本研究對山東地區(qū)疑似患大腸桿菌病的家禽進行大腸桿菌分離鑒定，并對其進行藥物敏感性試驗，從而了解大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥情況，以期為禽大腸桿菌病的臨床用藥提供指導(dǎo)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

從山東省各地區(qū)收集疑似患有大腸桿菌病的雞，經(jīng)剖檢觀察初步診斷是否患有大腸桿菌病，在無菌環(huán)境下取其病變的器官(如肝臟或卵黃)，做好標記及時放于冰箱4 ℃冷藏備用。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯（北京陸橋）、 伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋）、 乙腈（天津富宇）、甲酸（天津大茂）、無水乙醇（煙臺遠東）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（北京毅新博創(chuàng)）、藥敏試驗紙片：阿莫西林鈉（40 μg/片）、慶大霉素（20 μg / 片）、單硫酸卡那霉素（20 μg/片）、安普霉素（20 μg/片）、氟苯尼考（20 μg/片）、鹽酸土霉素（30 μg/片）、泰樂菌素（30 μg/片）、多西環(huán)素（20 μg/片）、磷霉素鈉（20 μg/片）、粘桿菌素（15 μg/片）、利福平（20 μg/片）、克林霉素（20 μg/片）、痢菌凈（20 μg/片）、環(huán)丙沙星（15 μg/片）

1.3 主要儀器與耗材

高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州國宇）、恒溫搖床（常州國宇）、飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)Clin-ToF-Ⅱ型儀器（北京毅新博創(chuàng)）、超凈臺（上海樹立）、耗材有解剖剪、接種環(huán)、消毒鑷子、酒精燈、滅菌試管、培養(yǎng)皿、移液槍及槍頭等。

1.4 大腸桿菌的分離鑒定

將冷藏備用的病變器官表面灼燒滅菌，在無菌條件下用滅菌接種環(huán)鉤取內(nèi)部病料，接種到伊紅美藍培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落生長狀態(tài)，對疑似大腸桿菌菌落進行編號E-1、E-2……E-59，通過質(zhì)譜系統(tǒng)進行鑒定。具體步驟：用接種環(huán)取單菌落于300 μL純水中，加入900 μL無水乙醇，震蕩，12 000 r/min離心2 min，棄去乙醇，繼續(xù)12 000 r/min離心2 min，自然干燥；加50 μL 70%甲酸，充分震蕩，再加50 μL 乙腈，充分震蕩，12 000 r/min離心2 min，取1 μL上清點到靶板上，室溫干燥，加1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸覆蓋在樣品上，自然干燥，然后上機檢測；置信度≥25分，表示結(jié)果可信，大腸埃希氏桿菌ATCC8739為儀器校正菌種，即標準株。

1.5 大腸桿菌抗生素藥物敏感試驗

采用K-B紙片法，將分離鑒定的大腸桿菌進行藥物敏感試驗。挑取鑒定后的單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18 h，然后用平板表面散布法進行活菌計數(shù)，統(tǒng)一調(diào)整細菌濃度為5×108CFU/mL。取100 μL均勻涂布于培養(yǎng)基上，室溫干燥3~5 min，用無菌鑷子夾取不同抗生素藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，兩紙片間距不小于24 mm，紙片距離平板邊緣不小于15 mm，并做好標記。藥物敏感試驗判定標準即抑菌圈直徑標準判定：若抑菌圈直徑大于20 mm，判為高敏；若抑菌圈直徑為10~20 mm，判為中敏；若抑菌圈直徑為小于10 mm，判為低敏；若抑菌圈直徑為0，判為抗藥。

2 結(jié)果分析

2.1 大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果

從59份樣品中分離得到45株疑似大腸桿菌菌株，分離的菌株在伊紅美藍培養(yǎng)基上長出黑色、稍凸的圓形菌落，直徑大小約2~5 mm，菌落邊緣整齊且表面光滑濕潤，并帶有金屬光澤（圖1）；表1為飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定結(jié)果。經(jīng)質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定后，45株菌的鑒定結(jié)果顯示置信度均≥25。

表1 飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定結(jié)果

圖1 大腸桿菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（詳見附錄彩圖）

2.2 大腸桿菌的抗生素藥敏結(jié)果

見表2。45株大腸桿菌的耐藥試驗顯示，對泰樂菌素的耐藥率達100%，對克林霉素的耐藥率高達95.6%，對阿莫西林鈉、鹽酸土霉素、磷霉素鈉的耐藥率超過80%；對環(huán)丙沙星敏感度相對較高，高敏菌株比例占20%，對慶大霉素、安普霉素、粘桿菌素、利福平、痢菌凈、環(huán)丙沙星有一定的敏感度，中高敏菌株的比例超過60%。

表2 大腸桿菌藥敏結(jié)果

3 討論

長期以來禽大腸桿菌病主要依靠抗菌藥物進行防控，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性增強，耐藥譜擴大。本試驗分離的45株禽大腸桿菌對14種藥物存在不同程度的耐藥性，環(huán)丙沙星的敏感度相對較高，高敏株比例占20%；對慶大霉素、安普霉素、多西環(huán)素、粘桿菌素、利福平、痢菌凈敏感性變化比較大；對泰樂菌素、克林霉素、阿莫西林鈉、鹽酸土霉素、磷霉素鈉的耐藥性較高。本試驗結(jié)果與牛玉娟[4]、柳志余[5]等人的結(jié)果部分相近，分離培養(yǎng)的禽大腸桿菌對環(huán)丙沙星、慶大霉素、安普霉素、粘桿菌素、痢菌凈等有一定的敏感性，這說明了目前我國禽源性大腸桿菌的耐藥情況基本類似，同時對部分藥物如磷霉素鈉、氟苯尼考的敏感性也存在著一定的差異，這可能與養(yǎng)殖場的用藥情況有一定的關(guān)系，由于不同養(yǎng)殖取樣用藥習(xí)慣差異，導(dǎo)致不同區(qū)域耐藥性差異較大。細菌的耐藥性除了與養(yǎng)殖場的投藥有直接關(guān)系外，還與當?shù)氐臍夂蜃兓灿忻懿豢煞值穆?lián)系，因此要實時動態(tài)監(jiān)測大腸桿菌對藥物的敏感性，選擇合適的藥物進行預(yù)防和治療，針對不同地區(qū)的耐藥程度，選擇敏感的藥物進行防治。

4 小結(jié)

大腸桿菌是一種條件性致病菌，本身存在于動物體內(nèi)。防治大腸桿菌病的發(fā)生，首先要改善飼養(yǎng)環(huán)境，加強飼養(yǎng)管理，落實好衛(wèi)生防疫措施，以減少各種誘發(fā)的因素；另外，在臨床上不要盲目地長期、大劑量使用同一種藥物，以避免造成耐藥性菌株出現(xiàn)，使用抗生素時注意聯(lián)合用藥及交替用藥，以減少人力、物力的浪費。同時要根據(jù)機體的臨床癥狀，采取綜合措施，及時調(diào)整治療方案，防止病情的復(fù)雜化。