陳建豪，買吾蘭·孜克牙，楊夷平，楊康，張國新，古麗巴哈·卡德爾，阿達(dá)來提·尤素甫，坤巴哈斯·沙合依，馬春江

（哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000）

高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）是由H5和H7亞型HPAI病毒感染引起的一種禽類烈性、高度接觸性傳染病，也是人獸共患傳染病[1]，被世界衛(wèi)生組織列為一類動(dòng)物疫病。該病不但造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也可引起人感染HPAI而死亡，引發(fā)人們高度關(guān)注。目前世界各國預(yù)防HPAI發(fā)生的最主要手段是進(jìn)行疫苗接種，我國主要采取疫苗免疫聯(lián)合撲殺感染家禽的綜合防控措施。

隨著基因工程技術(shù)如DNA重組技術(shù)、反向遺傳學(xué)技術(shù)及基因編輯技術(shù)的發(fā)展，禽流感疫苗的研發(fā)逐漸從傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒活疫苗向基因工程疫苗過渡[2]，但從傳統(tǒng)來說，滅活油乳劑疫苗依舊是預(yù)防禽流感的首選疫苗，因?yàn)樗庖咝Ч?、安全可靠[3]。選擇合適的疫苗和合理免疫程序?qū)τ贖PAI的防控具有重要的意義。本試驗(yàn)選取了三個(gè)廠家最新生產(chǎn)的重組禽流感H5+H7三價(jià)滅活苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）免疫蛋雞，通過檢測抗體效價(jià)研究HPAI免疫抗體消長規(guī)律，同時(shí)評估免疫效果，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選最合適的重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活苗，優(yōu)化免疫程序，為基層疫苗免疫提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

三種重組禽流感病毒H5+H7三價(jià)滅活苗疫苗均源于自治區(qū)招標(biāo)采購中標(biāo)廠家。禽流感（H5N1 Re-11）和禽流感（H5N1 Re-12）病毒抗原批號分別為2020001和2021003，生產(chǎn)廠家均為哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)動(dòng)物來自哈密轄區(qū)某蛋雞場。

1.2 試驗(yàn)分組

選取18日齡左右雛雞240羽，隨機(jī)分為3組，每組80只。按照免疫方案和疫苗說明書進(jìn)行免疫注射，18日齡首免，46日齡強(qiáng)化免疫，疫苗免疫后隨時(shí)觀察并記錄試驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)。具體見表1。

表1 試驗(yàn)蛋雞分組免疫表

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集 分別于25、32、39、46、60、75、105、135、165日齡采集血液樣品，每個(gè)日齡每組隨機(jī)抽取30只雞，18日齡采集40份血液樣品，無菌分離血清后-20℃保存。

1.3.2 檢測方法與判定 血凝（Hemagglutination test，HA）試驗(yàn)和血凝抑制（Hemagglutination inhibition test，HI）試驗(yàn)根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2020）規(guī)定的操作規(guī)范進(jìn)行，待檢血清HI抗體滴度≥4log2時(shí)判為陽性，視為免疫抗體合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 母源抗體檢測結(jié)果

18日齡采集40份血清樣本做母源抗體檢測，禽流感H5N1（Re-11）平均抗體效價(jià)為2.38log2，抗體合格率為20%；禽流感H5N1（Re-12）平均抗體效價(jià)為2.30log2，抗體合格率為20%；禽流感H7N9（H7-Re3）平均抗體效價(jià)為0.75log2，抗體合格率為0%。檢測結(jié)果表明，此時(shí)雞群母源抗體效價(jià)較低，不足于抵抗野毒感染。

2.2 H5N1（Re-11）檢測結(jié)果

HI抗體效價(jià)顯示，A、B、C三組在18日齡首免后一周，H5N1（Re-11）平均抗體效價(jià)均略微降低，免疫后2周抗體效價(jià)開始迅速上升，3周時(shí)抗體合格率達(dá)到90%，4周抗體效價(jià)達(dá)到高峰，平均抗體效價(jià)在7log2左右，抗體效價(jià)差異不大，變異系數(shù)最高的A組較最低的C組變異系數(shù)高2.85%。A、B、C三組在46日齡二免后二周，H5N1（Re-11）平均抗體效價(jià)達(dá)到較高水平（9log2以上），抗體合格率達(dá)到100%；75日齡時(shí)抗體效價(jià)達(dá)到峰值，隨后緩慢下降，變異系數(shù)最高的C組較最低的B組變異系數(shù)高8.18%。二免后四個(gè)月（165 d），H5N1（Re-11）平均抗體效價(jià)＞7log2。抗體檢測結(jié)果見表2。

表2 H5N1（Re-11）株平均抗體效價(jià)（log2）檢測結(jié)果

2.3 H5N1（Re-12）檢測結(jié)果

H5N1（Re-12）平均抗體效價(jià)檢測結(jié)果與H5N1（Re-12）相似。三組試驗(yàn)雞在一免后4周抗體效價(jià)達(dá)到高峰，平均抗體效價(jià)在7log2左右，變異系數(shù)最高的A組較最低的B組變異系數(shù)高3.67%；二免后1個(gè)月，抗體效價(jià)達(dá)到峰值，隨后緩慢下降，變異系數(shù)最高的C組較最低的A組變異系數(shù)高3.01%；二免后四個(gè)月（165 d），H5N1（Re-12）平均抗體效價(jià)在6log2左右，B組出現(xiàn)單個(gè)樣品抗體效價(jià)不合格。結(jié)果見表3。

表3 H5N1（Re-12）株平均抗體效價(jià)（log2）檢測結(jié)果

2.4 H7N9（H7-Re3）檢測結(jié)果

A、B、C三組在18日齡首免后一周，H7N9（H7-Re3）平均抗體效價(jià)均略微上升，3周時(shí)抗體合格率達(dá)到93%以上，4周抗體效價(jià)達(dá)到高峰，平均抗體效價(jià)在6log2左右，變異系數(shù)最高的B組較最低的A組變異系數(shù)高0.36%。75日齡時(shí)抗體效價(jià)達(dá)到峰值，隨后緩慢下降，變異系數(shù)最高的C組較最低的A組變異系數(shù)高7.10%。二免后四個(gè)月（165 d），H7N9（H7-Re3）平均抗體效價(jià)大于7log2。檢測結(jié)果見表4。

3 討論

禽流感病毒極易通過變異和重組產(chǎn)生新的毒株，因其感染性和致病性強(qiáng)等對禽業(yè)造成嚴(yán)重危害以外，還對人類健康造成巨大的威脅。H5、H7亞型禽流感病毒已在全球60多個(gè)國家和地區(qū)引起了疫情，人感染H7N9禽流感病毒也時(shí)有報(bào)道[4-5]。接種疫苗是目前預(yù)防和控制禽流感最有效的方式之一，禽流感疫苗的使用對同種HA亞型HPAIV引起的禽流感保護(hù)力有所降低，但可有效減輕家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中的臨床發(fā)病癥狀，從而降低、甚至避免重大經(jīng)濟(jì)損失。劉艷晶等[6]研究表明，使用與疫苗株存在抗原差異的H5N6、H7N9和H5N8亞型毒株攻毒，重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）免疫雞在攻毒后仍然可以獲得臨床保護(hù)，無明顯臨床癥狀，并可有效阻止大多抗原變異毒株在體內(nèi)的復(fù)制。本試驗(yàn)通過研究重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）疫苗免疫家禽后抗體的消長規(guī)律，評估免疫后雞群的抗體水平，為現(xiàn)有疫苗的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本試驗(yàn)中HI抗體效價(jià)顯示，三組疫苗免疫雞群后的三個(gè)毒株的平均抗體效價(jià)基本趨于一致，但三組疫苗初次免疫2周后H5N1Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株平均抗體效價(jià)（A組＞B組＞C組）差異較為顯著（P＜0.05），隨后三組疫苗免疫抗體效價(jià)快速上升，趨于一致，分析可能是疫苗佐劑等原因影響疫苗釋放有關(guān)。隨后H5N1 Re-11株、H5N1 Re-12株、H7N9 H7-Re3株在一免后28 d和二免后1個(gè)月，各組內(nèi)和組間平均抗體效價(jià)差異較小，變異系數(shù)值也較低，差異不顯著（P＞0.05），抗體合格率分別為90%以上和100%。結(jié)果表明，3個(gè)廠家的重組禽流感三價(jià)疫苗均具有良好的免疫原性。

免疫程序的選擇和優(yōu)化對于禽流感的防控也起到至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)中選擇雞群18日齡首免，母源抗體監(jiān)測中三個(gè)毒株的平均抗體效價(jià)均低于4log2，其中H7N9 H7-Re3株抗體效價(jià)為0，與劉婷婷等[7]蛋雞H5、H7亞型禽流感病毒母源抗體消長規(guī)律的研究基本一致，一免后一周疫苗保護(hù)效力還未形成，存在野毒感染的威脅，所以雞群的首免時(shí)間可以提前至15日齡左右。在禽流感三價(jià)滅活苗一免后28 d，此時(shí)抗體效價(jià)達(dá)到高峰，測定的H5N1 Re-11株、H5N1 Re-12株和H7N9 H7-Re3株的抗體效價(jià)均在6log2以上，產(chǎn)生的抗體較為均衡；二免后1個(gè)月再次升至高峰，達(dá)9log2以上，隨后緩慢下降；在二免后120 d，H5N1 Re-11株和H7N9 H7-Re3株抗體水平仍維持在7log2以上，H5N1 Re-12株抗體水平維持在5.8log2以上。結(jié)果表明，雛雞一免產(chǎn)生的抗體效價(jià)雖然能夠有效保護(hù)雞群，但整體的抗體效價(jià)不高，對于飼養(yǎng)周期較短的家禽可以免疫一次。對于飼養(yǎng)期較長的種禽、蛋禽，可在一免后28 d強(qiáng)化免疫，可保證雞群整體的抗體效價(jià)保持一個(gè)較高水平；同時(shí)建議開產(chǎn)前進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，之后每隔6個(gè)月加強(qiáng)免疫一次。