李朝云，唐平華，羅 平，付宇豪，曾祥衛(wèi)，佘露露*

(1.仁懷醬香白酒科研所，貴州遵義 564500；2.貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)北街酒廠(集團(tuán))有限責(zé)任公司，貴州遵義 564500)

醬香白酒是中國(guó)特有的一種高度蒸餾酒，生產(chǎn)過(guò)程中采用高溫制曲工藝，使其富集了大量的微生物和酶系[1]。在發(fā)酵前期積累和富集大量的香味物質(zhì)，在陳放過(guò)程中，大曲繼續(xù)網(wǎng)羅空氣和環(huán)境中的微生物使其微生物群落更加豐富，微生物菌群在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不斷演替，充分利用高粱和大曲中的各類物質(zhì)，形成醇厚豐滿的醬香型白酒基酒[2-4]。大曲作為釀酒糖化劑，主要是提供多樣的微生物用于產(chǎn)酒和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[5]，同時(shí)補(bǔ)充了生產(chǎn)過(guò)程中的淀粉含量，有利于提高白酒產(chǎn)量[6]。分析大曲微生物的多樣性，可以更好的了解大曲中的微生物種類和數(shù)量，為酒類風(fēng)味物質(zhì)的形成和微生物的選育提供理論依據(jù)[7]。

第二代高通量測(cè)序技術(shù)可以更加精確、快速的分析樣品中微生物結(jié)構(gòu)，成為白酒生產(chǎn)過(guò)程中微生物菌群研究的主要手段[8]。在制曲中，發(fā)酵初期曲塊處于常溫狀態(tài)，適宜酵母大量增殖，在發(fā)酵過(guò)程中，溫度逐漸升高，酵母菌生長(zhǎng)被抑制，在發(fā)酵中后期僅能少量或不能檢出酵母，但是可檢出大量細(xì)菌和霉菌等[9]；在堆積過(guò)程中，初期主要是酵母的富集過(guò)程，在堆積前后酵母數(shù)量明顯增加，且增加幅度有1～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，增加幅度因堆積輪次和車間不同而略有差異[10-12]。

仁懷產(chǎn)區(qū)現(xiàn)階段對(duì)醬香白酒生產(chǎn)工藝已經(jīng)建立較完整的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，但未從醬香白酒生產(chǎn)過(guò)程微生物菌落演替方面詮釋醬香白酒生產(chǎn)過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。探明大曲中微生物的種類和數(shù)量，是探究醬香白酒風(fēng)味形成不可或缺的一部分。以陳放1 個(gè)月、4 個(gè)月、6 個(gè)月的大曲為研究對(duì)象，探究陳放不同時(shí)間大曲中的菌群結(jié)構(gòu)，為后續(xù)探究醬香白酒風(fēng)味形成夯實(shí)基礎(chǔ)，對(duì)仁懷醬香型白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義，并為地方產(chǎn)業(yè)的推進(jìn)及進(jìn)步提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：1 個(gè)月、4 個(gè)月、6 個(gè)月黃曲、黑曲、白曲分別命名為：XH、XK、XB、FH、FK、FB、SH、SK、SB，大曲樣品來(lái)自貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)北街酒廠(集團(tuán))有限責(zé)任公司曲房陳放大曲，將所得大曲粉碎后用四分法進(jìn)行縮分取樣、備用。

試劑：試劑盒Illmina 公司Hiseq Rapid SBS Kit v2(FC-402-4023 500 Cycle)等。

儀器設(shè)備：PCR 擴(kuò)增儀（2720），美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電泳儀（DYY-6C），北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（BG-gdsAUTO(130)），北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

醬香大曲樣品由四川帕諾米克生物科技有限公司測(cè)序，PE250 測(cè)序方式，采用Qiagen Powersoil pro 試劑盒提取黃曲、黑曲和白曲樣品中的DNA。在細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物Primer5'-3'：515F (5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），PCR 擴(kuò)增用酶為TOYOBO KO EPlus-Neo DNA Polymerase（KOD-401B），擴(kuò)增體系為50μL：5 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 μL 2 mmol/L dNTPS，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL 上游 引 物U515F，1.5 μL 下 游 引 物U806R，1 μL KOD-Plus-Neo(1U/μL)，2 μL DNA 模板，31 μL 超純水。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃1 min，1個(gè)循環(huán)；變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s 和延伸72 ℃30 s，25～30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，1 個(gè)循環(huán)；4 ℃保溫。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次PCR 技術(shù)重復(fù)，取線性期PCR 產(chǎn)物等量混合后用于后續(xù)建庫(kù)[13]。

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用2%的瓊脂糖凝膠，每個(gè)樣本進(jìn)行3 次重復(fù)，取線性期PCR 產(chǎn)物等量混合后用NEW ENGLAND BioLabs 公司NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫(kù)。進(jìn)一步在Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)開(kāi)展高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測(cè)序所得序列通過(guò)FLASH 拼接雙端序列、過(guò)濾去除低質(zhì)量序列，基于Uchime 算法和gold數(shù)據(jù)庫(kù)去除嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)Effiective Tag?；赨search 軟件，使用UPARSE 算法在97 %的一致性水平上進(jìn)行Operational Taxonomic Unit（OUT）聚類?；赨CLUST 分類法與SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因序列比對(duì)和注釋分析。使用R 語(yǔ)言和ggplot2包作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

通過(guò)Usearch 算法在97 %的一致性水平上進(jìn)行OTU 聚類。計(jì)算Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)（以確定物種豐富度）、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)（以確定物種多樣性）及檢測(cè)到的物種數(shù)目，以描述樣品中的細(xì)菌菌群多樣性，分析測(cè)序指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大曲細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)

隨著樣本測(cè)序深度的增加，各大曲樣品的真菌測(cè)序Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)都呈現(xiàn)逐漸平緩的變化趨勢(shì)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果已經(jīng)覆蓋絕大部分真菌，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理、測(cè)序深度足夠?？梢钥闯鲭S著大曲陳放時(shí)間延長(zhǎng)，大曲中真菌多樣性呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，各個(gè)樣品的Coverage 指數(shù)均達(dá)到了99.99 %以上，說(shuō)明在此條件下的測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果完全能夠反映所測(cè)樣本中真菌的真實(shí)情況，絕大部分的微生物種系類型都被檢測(cè)到，在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)行后續(xù)的研究分析。

2.2 物種組成結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同分組在各分類水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。根據(jù)群落柱形圖，可以直觀看出各樣本在某一分類學(xué)水平上主要包括的微生物和樣本中各微生物的相對(duì)豐度。

圖2 門水平上細(xì)菌物種豐度組成

群落柱形圖表明，樣品中共檢出10 個(gè)菌門，其中硬壁菌門（Firmicutes）是白曲中的第一優(yōu)勢(shì)菌門，在1 個(gè)月、4 個(gè)月和6 個(gè)月大曲中分別占總微生物93.61 %、92.05 %、92.61 %，F(xiàn)irmicutes 在XH 和FH 中含量分別為83.06 %、89.26 %，在SH 中含量降低到18.52 %，F(xiàn)irmicutes 在黑曲中含量分別為49.59 %、37.62 %、79.90 %；放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門(Proteobacteria)在XB、FB、SB 中含量無(wú)較大變化，在XH、FH、SH 中均呈現(xiàn)先減少后增大的情況，在FH 中Actinobacteria 和Proteobacteria分別占總微生物26.01 %，44.13 %；Actinobacteria在黑曲中含量先增加后減少，Proteobacteria 變化趨勢(shì)相反，但最終含量均保持在10 %以內(nèi)；Bacteroidetes 在SH 中占比超過(guò)1 %，其余菌門含量均低于0.5%。上述結(jié)果與已報(bào)道的醬香大曲微生物在門類結(jié)構(gòu)上具有相似性[14-15]，郭敏[16]對(duì)醬香大曲制曲中微生物多樣性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在大曲制作過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌門是Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria；Zhang 等[17]對(duì)清香型白酒釀造用大曲細(xì)菌組成及多樣性研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌主要為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Chloroplast(藍(lán)藻菌門)，其中Firmicutes 為優(yōu)勢(shì)菌門；樊建輝等[18]研究仰韶陶融型白酒釀造用大曲可培養(yǎng)微生物的多樣性，結(jié)果表明Firmicutes 和Proteobacteria 為優(yōu)勢(shì)菌門；王曉丹等[19]從醬香大曲樣品中共檢出細(xì)菌6個(gè)菌門，主要為Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 等，并發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)與機(jī)械大曲中所檢出的微生物，在門水平上兩種制曲所生產(chǎn)曲胚中細(xì)菌的生態(tài)多樣性變化規(guī)律相似。

利用高通量測(cè)序方法從9 例大曲中共檢出109個(gè)菌屬，由圖3 可知，枝芽胞桿菌屬（Virgibacillus）是在9 例大曲中含量均超過(guò)10 %的菌屬，在SB 中含量最高，達(dá)到總含量的35.74 %，但是在SH 中含量?jī)H有3.42%；克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）新曲中含量均高于12 %，隨著陳放過(guò)程，從XB 中的12.03 %提高到SB 中30.86 %，但在黃曲中的含量變趨勢(shì)正好相反，從XH中的32.11%，到SH含量?jī)H3.52 %，黑曲中含量無(wú)明顯線性關(guān)系；糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）在白曲陳放過(guò)程中期含量基本保持不變，在FK 中含量高達(dá)52.44 %，是所有樣品中菌屬含量最高的；葡萄球菌屬（Staphylococcus）在FH 中含量達(dá)到13.45 %，Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）在XB 中含量達(dá)到21.90 %，其余各類菌屬含量均低于10 %；高溫放線菌屬(Thermoactionmyces)表現(xiàn)出分布廣泛、耐受溫度高、生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值和意義，是現(xiàn)階段醬香大曲高溫制曲的重要研究菌種，有研究從高溫放線菌中提取分離高溫酶如α-高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等應(yīng)用于大分子物質(zhì)的分解[20-23]。

圖3 屬水平上細(xì)菌物種豐度組成

根據(jù)大曲種類，在屬水平對(duì)其分析得到，在1個(gè)月、4 個(gè)月、6 個(gè)月大曲中分別檢出155 個(gè)、103個(gè)、225 個(gè)屬，其中共有的有71 個(gè)屬，分別單獨(dú)含有的有41 個(gè)、6 個(gè)、99 個(gè)屬，數(shù)據(jù)顯示，在屬水平上分析大曲在陳放過(guò)程中，屬水平上數(shù)量先減少后增加，6 個(gè)月陳曲中屬種類最多，這可能是大曲在陳放過(guò)程中網(wǎng)羅空氣和環(huán)境中的微生物以豐富自身微生物種類使得微生物菌群更加豐富[24-25]。

2.3 通過(guò)LEFse分析組間菌群差異

在醬香高溫制曲過(guò)程，通過(guò)LEfSe 分析探究不同陳放時(shí)間下大曲細(xì)菌微生態(tài)結(jié)構(gòu)中物種的差異性，可以揭示制曲過(guò)程微生物結(jié)構(gòu)特征和發(fā)酵、風(fēng)味動(dòng)力關(guān)鍵調(diào)控因子，有利于調(diào)控曲胚發(fā)酵參數(shù)和提升曲胚發(fā)酵質(zhì)量。

圖4 大曲屬水平物種韋恩圖

由圖5 可以看出，在屬水平上新曲中新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）為顯著富集的差異物種，在發(fā)酵過(guò)程中可由碳水化合物氧化產(chǎn)酸但不能發(fā)酵產(chǎn)酸，現(xiàn)階段該菌株研究較少，是一種亟待開(kāi)發(fā)的菌屬[26-27]；4 個(gè)月大曲中Staphylococcus是顯著富集的差異物種，Staphylococcus是革蘭氏陽(yáng)性球菌且多數(shù)為非致病菌，Thermoactionmyces也是顯著富集的差異物種[28-29]，Thermoactionmyces大都適宜在高溫下生活，表現(xiàn)出分布廣泛、耐受溫度高、生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值和意義[21]。從高溫放線菌中提取分離高溫酶如α-高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等應(yīng)用于大分子物質(zhì)的分解[20]，也有研究表明高溫放線菌在醬香大曲細(xì)菌的相對(duì)含量占34.40%，運(yùn)用PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)醬香型和芝麻香型高溫大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析研究，均發(fā)現(xiàn)高溫放線菌的存在[30]，羅小葉等[21]以醬香型大曲為實(shí)驗(yàn)原材料，從茅臺(tái)大曲中分離純化5 株具有高溫放線菌菌落形態(tài)特征的菌株，分別有3 株嗜溫高溫放線菌（Thermoactinomyces thalpohillus）、1 株甘蔗高溫放線菌（Thermoactinomyces sacchari)、1 株高溫放線糖萊斯菌（Laceyella sacchari），同時(shí)發(fā)現(xiàn)高溫放線菌產(chǎn)生的水解酶對(duì)釀酒原料的分解及促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)代謝產(chǎn)生具有一定的作用。在6 個(gè)月大曲中乳球菌屬(Lactococcus)為顯著富集的差異物種，這一類細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性屬化能自養(yǎng)型微生物，以碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸，L(+)-乳酸為主，不產(chǎn)氣，可能是白酒中乳酸的主要來(lái)源[31]。

圖5 大曲LEFse差異分析圖

2.4 PCA分析

PCA 是對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，以此提取數(shù)據(jù)中最主要的因素，發(fā)現(xiàn)復(fù)雜數(shù)據(jù)的規(guī)律。在PCA分析中，樣品的菌群越相似，則兩個(gè)樣品距離越近。

在圖6 中，橫坐標(biāo)對(duì)差異影響貢獻(xiàn)率為70.05 %，縱坐標(biāo)對(duì)差異影響的貢獻(xiàn)率為22.77 %。部分1 個(gè)月、4 個(gè)月、6 個(gè)月大曲距離很近，菌群相似，但是還是明顯看出各類大曲樣品并沒(méi)有聚集在一起，這說(shuō)明1個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月大曲微生物構(gòu)成差異較大。

圖6 大曲PCA分析圖

2.5 PCoA分析

PCoA 是根據(jù)特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出主要的元素和結(jié)構(gòu)，選取貢獻(xiàn)量最大的主坐標(biāo)組合作圖。兩個(gè)樣品的菌群組成越相似，兩個(gè)樣品距離越近。

在圖7 中，PCoA 的橫坐標(biāo)對(duì)差異影響貢獻(xiàn)率為48.82 %，縱坐標(biāo)對(duì)差異影響的貢獻(xiàn)率為16.66 %。通過(guò)基于Unweighted Unifrac 距離計(jì)算的PCoA，可以發(fā)現(xiàn)除4 個(gè)月大曲明顯聚集在一起外，新曲和6 個(gè)月大曲樣品距離較遠(yuǎn)，沒(méi)有明顯聚集的表現(xiàn)。

圖7 大曲PCoA分析圖

2.6 UPGMA聚類樹(shù)

在微生物生態(tài)研究當(dāng)中，UPGMA 分類樹(shù)可以用于研究樣本間的相似性，越相似的樣本擁有越短的共同分支。如圖8 所示，各個(gè)大曲樣本除XK 和FK、XB 和SK 菌群組成相似外，其余大曲樣本均無(wú)明顯相似性，UPGMA 聚類樹(shù)和樣本屬水平上的物種豐度聚類圖結(jié)果與PCoA分析結(jié)果相似。

圖8 樣本間Beta多樣指數(shù)UPGMA聚類圖

3 結(jié)論

對(duì)北街酒廠陳放不同時(shí)間的9 例大曲細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究，分別鑒定出10 個(gè)菌門和109 個(gè)菌屬，通過(guò)對(duì)不同陳放時(shí)間大曲細(xì)菌多樣性研究分析，明確Firmicutes 在白曲中為第一優(yōu)勢(shì)菌門，Actinobacteria、Proteobacteria 是僅次于Firmicutes 的兩個(gè)菌門；Virgibacillus是大曲中的重要菌屬，占微生物比例均超過(guò)10 %，Kroppenstedtia、Saccharopolyspora都屬于大曲中優(yōu)勢(shì)菌屬；對(duì)不同陳放時(shí)間的大曲差異性分析發(fā)現(xiàn)，在1個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月大曲分別檢出155 個(gè)、103 個(gè)、225 個(gè)屬，其中共有的有71個(gè)屬，分別單獨(dú)含有的有41 個(gè)、6 個(gè)、99 個(gè)屬，表明大曲在陳放過(guò)程中網(wǎng)羅了環(huán)境中的微生物使得大曲微生物菌群更加豐富，側(cè)面印證了環(huán)境微生態(tài)會(huì)通過(guò)影響大曲微生物多樣性進(jìn)而影響醬香白酒的釀造，環(huán)境微生物是醬香白酒釀造不可或缺的微生物組成部分，大曲通過(guò)品溫上升的篩選，最終實(shí)現(xiàn)環(huán)境、原料等外界中的有益菌向大曲遷移和富集；發(fā)現(xiàn)新曲中Novosphingobium為顯著富集的差異物種，4個(gè)月大曲中Staphylococcus和Thermoactionmyces為顯著富集的差異物種，6個(gè)月大曲中Lactococcus為顯著富集的差異物種。這是大曲在開(kāi)放式發(fā)酵條件下形成的具有標(biāo)志性的菌群結(jié)構(gòu)，或可成為大曲陳放時(shí)間鑒別的主要依據(jù)，對(duì)大曲PCA 和PCoA分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月大曲微生物構(gòu)成差異較大。UPGMA 聚類樹(shù)分析和大曲屬水平上的物種豐度聚類圖分析結(jié)果再一次印證不同存放時(shí)間大曲樣本均無(wú)明顯相似性。大曲提供了醬香白酒釀造過(guò)程主要的酶、氨基酸、糖等發(fā)酵前體物質(zhì)，是醬香型白酒生產(chǎn)的“骨架”。所以，探究不同陳放時(shí)間大曲的微生物結(jié)構(gòu)特征為醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生提供了理論依據(jù)，同時(shí)為大曲中特征微生物的分離篩選培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)支撐，從微生物角度詮釋了高溫大曲陳放過(guò)程是醬香白酒不可分割的釀造工藝。

圖9 樣本屬水平上的物種豐度聚類圖