摘要：鐵皮石斛在“九大仙草”中名列魁首，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗風(fēng)濕、降血糖血脂等功效，其分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究受到了廣泛關(guān)注。開(kāi)展對(duì)鐵皮石斛的研究，不僅具有重要的科學(xué)意義，還具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文從鐵皮石斛基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因克隆與功能、轉(zhuǎn)基因研究等方面對(duì)鐵皮石斛的分子生物學(xué)研究進(jìn)行綜述，為加快分子生物學(xué)技術(shù)在鐵皮石斛研究中的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；基因組學(xué)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；轉(zhuǎn)基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008－0457（2023）04－0045－06

國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.007

蘭科石斛屬鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）的干燥莖［1］，又名耳環(huán)石斛、黑節(jié)草、救命仙草等［2］。主要分布于安徽西南部（大別山）、四川、云南東南部［3］。鐵皮石斛在醫(yī)藥方面具有很高的藥用價(jià)值，既有滋陰清熱、益胃生津，又有抗癌和免疫調(diào)節(jié)等功效［4］。從現(xiàn)代藥理學(xué)角度來(lái)看，鐵皮石斛所含的多糖和芪類(lèi)化合物，可以清除體內(nèi)過(guò)多的自由基以達(dá)到延緩器官衰老的作用，并且對(duì)肝癌、胃癌、宮頸癌等細(xì)胞均有抑制效應(yīng)［5］。鐵皮石斛作為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，兼具藥物和保健的功效，是鐵皮石斛顆粒、石斛夜光片、鐵皮石斛膠囊、鐵皮石斛浸膏、鐵皮石斛含片等成藥的主要原料［6］。由于野生鐵皮石斛遭受人為采挖、生態(tài)環(huán)境破壞等原因，導(dǎo)致鐵皮石斛資源稀缺。再加上鐵皮石斛種子細(xì)小，成熟果實(shí)中的種子數(shù)量極多，呈粉塵狀，在自然環(huán)境中很難萌發(fā)，需要與某些真菌共生才能萌發(fā)，其野生資源已不多見(jiàn)［7］。國(guó)務(wù)院在1987年發(fā)布的《野生藥材資源保護(hù)管理?xiàng)l例》中將鐵皮石斛列為三級(jí)保護(hù)品種；1992年在《中國(guó)植物紅皮書(shū)》中被收載為瀕危植物［8］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，鐵皮石斛分子生物學(xué)的研究已成為目前的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)鐵皮石斛開(kāi)展了相關(guān)研究，在鐵皮石斛基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面取得了諸多進(jìn)展，這為鐵皮石斛基因克隆、基因編輯、基因轉(zhuǎn)化、分子標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)提供了研究基礎(chǔ)，也為鐵皮石斛植物的鑒別、植物生長(zhǎng)發(fā)育及代謝調(diào)控機(jī)制等相關(guān)研究提供了新的思路和參考。但有關(guān)鐵皮石斛功能基因分析、分子鑒定等研究領(lǐng)域尚缺乏系統(tǒng)的總結(jié)，限制了對(duì)鐵皮石斛的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。鑒于此，本文從鐵皮石斛基因功能、分子鑒定、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等角度，對(duì)鐵皮石斛相關(guān)分子生物學(xué)研究成果進(jìn)行綜述，并對(duì)當(dāng)前的問(wèn)題進(jìn)行探討，以期為該植物的保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)參考。

1基因組學(xué)研究

基因組數(shù)據(jù)可以為藥用植物提供遺傳基礎(chǔ)知識(shí)，以此來(lái)彌補(bǔ)植物遺傳和活性化學(xué)物之間的差距。由于鐵皮石斛基因組具有特殊的高雜合度和高重復(fù)性，使得最開(kāi)始鐵皮石斛基因組測(cè)序的研究遇到了挑戰(zhàn)。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，第二代Illumina高通量測(cè)序和第三代PacBio實(shí)時(shí)單分子測(cè)序的出現(xiàn)，多個(gè)課題組對(duì)鐵皮石斛基因組做出了解析。鐵皮石斛為二倍體單子葉的植物，染色體共有38條（2n=38），Yan等［9］采用二代測(cè)序（SGS）和三代測(cè)序（TGS）兩種技術(shù)進(jìn)行組裝得到了1.35Gb的鐵皮石斛全基因組序列，獲得了首個(gè)鐵皮石斛基因組草圖，觀察到存在有真菌共生、抗旱有關(guān)的基因家族有擴(kuò)張的趨勢(shì)，如調(diào)節(jié)氣孔密度和分布的SDD1基因，參與熱耐受和光敏色素信號(hào)通路的PPP7基因及3MAT等基因家族的擴(kuò)張可能和鐵皮石斛較強(qiáng)的抗旱能力有密切關(guān)聯(lián)。此外，研究者還分析了鐵皮石斛的主要藥用成分的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)參與多糖生成相關(guān)的SPS和SuSy基因大量重復(fù)，這為研究鐵皮石斛中石斛多糖積累的分子機(jī)制提供了思路，同時(shí)也為鐵皮石斛分子遺傳育種提供了潛在的靶標(biāo)基因。

與此同時(shí)，Zhang等［10］采用IIIuminaHiSeq2000測(cè)序平臺(tái)和SOAPdenovo2/Platanus組裝方式，對(duì)鐵皮石斛全基因組序列進(jìn)行研究，得到鐵皮石斛全基因組序列大小為1.01Gb，并預(yù)測(cè)了28910個(gè)蛋白編碼基因，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛存在和蝴蝶蘭類(lèi)似的全基因組復(fù)制事件，同時(shí)也觀察到其基因組中部分基因家族典型的擴(kuò)張事件。其中比較典型的有：萜類(lèi)合成相關(guān)TPS-a亞家族基因得到擴(kuò)張，家族成員基因數(shù)目遠(yuǎn)超過(guò)蝴蝶蘭，推測(cè)可能和石斛屬的種群擴(kuò)張有關(guān)，畢竟石斛屬擁有蘭科植物中最龐大的種群。鐵皮石斛基因組中抗性基因R基因家族也得到顯著的擴(kuò)張，達(dá)到了157個(gè)，R基因家族在植物的抗病過(guò)程中起著非常重要的作用，該基因家族的擴(kuò)張可能賦予鐵皮石斛更強(qiáng)大的病原免疫系統(tǒng)，幫助其在嚴(yán)酷的自然生境中生存。鈣依賴(lài)蛋白激酶（CDPKs）是植物中最重要的鈣離子傳感器，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中起著重要作用。Yang等［11］通過(guò)對(duì)鐵皮石斛全基因組分析，在鐵皮石斛中鑒定了24個(gè)編碼的鈣依賴(lài)蛋白激酶（CDPKs）基因，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，CDPK9-2和CDPK20-4分別與RbohD和RbohH相互作用，并參與了水楊酸/茉莉酸處理下過(guò)氧化氫的產(chǎn)生和氣孔孔徑的調(diào)控。Liu等［12］從鐵皮石斛基因組中鑒定了9個(gè)SPX家族基因，酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果表明，DoSPX4可與磷酸鹽高親和反應(yīng)因子（磷酸鹽高親和反應(yīng)因子）相互作用，結(jié)果突出了DoSPX4基因?qū)Φ土椎捻憫?yīng)作用。宋爭(zhēng)等［13］對(duì)鐵皮石斛phytocyanin基因家族的全基因組進(jìn)行分析，從鐵皮石斛全基因組中預(yù)測(cè)到包含PCLD結(jié)構(gòu)域的38個(gè)DoPCs，利用heatmap圖對(duì)DoPCs基因與美孢膠膜菌共生萌發(fā)的種子的表達(dá)分析得出，有7個(gè)基因在種子共生萌發(fā)中有著上調(diào)的表達(dá)，這為研究鐵皮石斛與微生物共生的分子機(jī)制提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

完善的鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)，為全基因組分析鑒定家族成員、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組分析、基因克隆等提供了有效資源和參考。也為研究鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控、脅迫生長(zhǎng)、闡明有關(guān)生物學(xué)路徑提供分子相關(guān)的信息支撐。

2轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

近年來(lái)，鐵皮石斛基因組的解析為轉(zhuǎn)錄組研究提供了很好的參考，鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)呈現(xiàn)了良好的發(fā)展勢(shì)頭。截至目前，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)超過(guò)30項(xiàng)，這些研究主要集中在鐵皮石斛組織特異性基因挖掘、有效活性成分生物合成路徑的解析，抗逆信號(hào)通路挖掘以及生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制、真菌共生機(jī)制等方面。目前已經(jīng)通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，挖掘出鐵皮石斛花、根、莖、葉等部位特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本2900余條，這些特異表達(dá)的基因可能在不同的器官中參與獨(dú)特的功能。研究表明，莖稈中發(fā)現(xiàn)的8個(gè)高豐度且特異表達(dá)基因可能參與碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝過(guò)程，在花中發(fā)現(xiàn)的25個(gè)特異基因可能參與石斛的開(kāi)花調(diào)控，這些為鐵皮石斛重要性狀的基因功能解析提供了良好的研究基礎(chǔ)。

生物堿是在鐵皮石斛中最早發(fā)現(xiàn)的活性成分，存在于鐵皮石斛的根、莖、葉、花等多個(gè)組織部位，其中原球莖含量最高，通過(guò)不同組織轉(zhuǎn)錄組差異分析，獲得了一些可能參與調(diào)控鐵皮石斛生物堿合成的基因。如Wang［14］通過(guò)分析原球莖和葉片的轉(zhuǎn)錄組差異，獲得了41個(gè)顯著差異基因，其中包含參與生物堿生物合成途徑中的異胡豆苷-β-葡萄糖苷酶、縫籽木榛合成酶（Geissoschizinesynthase，GS）和Vinorine合成酶的候選基因，這有助于在今后的研究中分析鐵皮石斛生物堿的合成機(jī)制。鐵皮石斛中的多糖是各種組織中最豐富的活性化合物，而成熟莖中的含量最高，通過(guò)對(duì)不同組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘了鐵皮石斛果糖和甘露糖生物合成的代謝途徑，并推測(cè)8個(gè)纖維素酶合酶（CSLA）基因家族成員在莖中的特異表達(dá)模式與莖中高甘露糖含量性狀密切相關(guān)。此外，使用PacBio測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)到鐵皮石斛中2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶和4個(gè)纖維素合成酶基因存在可變剪切，而且2個(gè)編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因在莖中的表達(dá)高于在葉中的表達(dá)，這些研究為進(jìn)一步研究鐵皮石斛富含多糖的分子機(jī)制提供了線(xiàn)索［15］。

此外，轉(zhuǎn)錄組被應(yīng)用于研究激素處理對(duì)鐵皮石斛藥效活性成分積累的影響。Niu等［16］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中水楊酸的存在可以增加鐵皮石斛幼苗中生物堿、多糖和類(lèi)黃酮等生物活性成分的積累，轉(zhuǎn)錄組差異分析發(fā)現(xiàn)多達(dá)107個(gè)參與這些活性成分生物合成的基因在激素處理組被上調(diào)，這些研究為進(jìn)一步推測(cè)基因的功能提供信息，也為鐵皮石斛活性化合物含量的品種選育提供借鑒。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)也被用于研究鐵皮石斛的其他生理過(guò)程。在自然界中，由于自交不親和性，鐵皮石斛通常很少形成種子。Chen等［17］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析獲得41個(gè)可能參與自交不親和的基因，包括6個(gè)鈣離子信號(hào)基因和11個(gè)S位點(diǎn)受體激酶相關(guān)基因，這為鐵皮石斛的遺傳機(jī)制和種群保護(hù)提供了有益的見(jiàn)解。此外，鐵皮石斛種子細(xì)小，胚胎發(fā)育不全，自然界中鐵皮石斛種子的萌發(fā)往往依賴(lài)與菌根真菌的共生關(guān)系。轉(zhuǎn)錄組研究表明內(nèi)源激素在鐵皮石斛種子共生萌發(fā)中起著至關(guān)重要的作用，接種菌根真菌后，種子與赤霉素（GA）生物合成相關(guān)的基因上調(diào)，因此推測(cè)GA3可能是鐵皮石斛種子萌發(fā)的關(guān)鍵信號(hào)分子［18］。這些結(jié)果為蘭科真菌共生和種子萌發(fā)提供了有價(jià)值的參考。

3基因克隆與功能研究

對(duì)鐵皮石斛功能基因的研究，可以揭示鐵皮石斛分子鑒定、生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控機(jī)制等。目前，對(duì)鐵皮石斛功能基因的研究主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控基因、抗逆基因等。

3.1參與脅迫響應(yīng)的基因

在大自然中的植物，一般生長(zhǎng)在干旱、鹽漬、高低溫度等環(huán)境中，這些環(huán)境對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到一定的制約作用［19］。隨著植物在大自然的進(jìn)化，植物為了抵抗和適應(yīng)環(huán)境的脅迫，形成了一系列較為獨(dú)特的防御機(jī)制來(lái)降低環(huán)境對(duì)植物本身的損害［20］。多梳類(lèi)（PcG）蛋白通過(guò)表達(dá)沉默同源異型基因來(lái)調(diào)控體節(jié)發(fā)育，PcG蛋白由兩個(gè)復(fù)合體構(gòu)成，分別是PRC1、PRC2，PRC2是負(fù)責(zé)標(biāo)記的沉默基因。仇漢林等［21］為了探討PRC2復(fù)合體對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)的影響，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)該基因?qū)Ψ巧锩{迫和病毒脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)PRC2復(fù)合體中的成員DoCLF在低溫、高溫和脫水等各種環(huán)境脅迫誘導(dǎo)。植物中類(lèi)受體激酶（RLK）在響應(yīng)生物、非生物脅迫因子中發(fā)揮極大的作用。高靜等［22］對(duì)鐵皮石斛RLK基因進(jìn)行克隆與分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)DoRLK基因的轉(zhuǎn)錄本在鐵皮石斛根中表達(dá)較高，可以說(shuō)明該基因參與植物組織的生長(zhǎng)發(fā)育，可能影響根的形成，這進(jìn)一步揭示RLK基因在鐵皮石斛與環(huán)境互作中的功能關(guān)系。植物中的晚期胚胎富集蛋白（LEA）就是一種與植物抗逆性密切有關(guān)的蛋白，凌鴻等［23］以鐵皮石斛種子為材料，克隆DoLEA2基因并對(duì)其進(jìn)行分析，得出其參與鐵皮石斛的生長(zhǎng)發(fā)育，且在高鹽脅迫的條件下通過(guò)表達(dá)積累來(lái)響應(yīng)環(huán)境脅迫，從而降低脅迫引起的對(duì)自身的損害。

3.2參與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的基因

劉楚琪等［24］對(duì)鐵皮石斛氨基酸通透酶基因DoAAP2進(jìn)行克隆與分析，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在莖和葉中的表達(dá)量較高，推測(cè)該蛋白參與了植物的光合作用，并且對(duì)鐵皮石斛成熟種子處于培養(yǎng)過(guò)程中的7個(gè)時(shí)期進(jìn)行試驗(yàn)分析，分別是：種胚活化期（P1）、原球莖形成期（P2）、原分生組織形成期（P3）、頂端分生組織形成期（P4）、橢球型原球莖期（P5）、葉原基維管系統(tǒng)形成期（P6）、根端分生組織形成期（P7），得出在P3、P4、P7時(shí)期的表達(dá)量較高，表明DoAAP2基因在鐵皮石斛的根、莖發(fā)育中起著重要的作用。在生物體中，要想實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等的調(diào)控，其中依賴(lài)泛素或類(lèi)泛素翻譯后的蛋白修飾起到重要的作用［25］，而泛素結(jié)合酶（UBC9）是唯一作用參與泛素化過(guò)程和類(lèi)泛素化過(guò)程的泛素結(jié)合酶［26］。馬凌暉等［27］對(duì)鐵皮石斛UBC9進(jìn)行克隆與分析，發(fā)現(xiàn)其在愈傷組織中表達(dá)量最高，在P1時(shí)期具有最高的表達(dá)量，可能促進(jìn)植物細(xì)胞的快速分裂、生長(zhǎng)，并在鐵皮石斛的愈傷組織和種子活化期高度表達(dá)。李依民等［28］通過(guò)對(duì)鐵皮石斛ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白F家族基因克隆及分析，從鐵皮石斛中分離到2個(gè)F家族ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與F家族ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的相似性高達(dá)80%以上，均在葉中高度表達(dá)，暗示可能在鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用。

在蛋白質(zhì)可逆磷酸化調(diào)控中蛋白磷酸酶是主要調(diào)控酶，屬于PP2Cs家族［29］，在植物中PP2Cs家族是調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶、脫落酸或受體激酶等信號(hào)的通路［30］。李依民等［31］對(duì)鐵皮石斛蛋白磷酸酶基因DoPP2C2進(jìn)行克隆與分析，獲得了基因全長(zhǎng)及分子特征，為鐵皮石斛在生長(zhǎng)發(fā)育中的分子作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為道地藥材形成機(jī)制的研究、良種培育提供了科學(xué)依據(jù)。劉亮亮等［32］克隆鐵皮石斛蛋白磷酸酶2A基因，其所在家族在調(diào)控植物生理代謝過(guò)程與基因分子的表達(dá)特征有著密切的關(guān)系，為揭示其在鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育中的分子作用奠定基礎(chǔ)。

3.3參與次生代謝相關(guān)的基因

鐵皮石斛的主要化學(xué)成分以多糖、生物堿、黃酮、萜類(lèi)為主，其中多糖是鐵皮石斛較為主要的活性成分之一。鐵皮石斛中的多糖類(lèi)可通過(guò)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的作用來(lái)清除人體內(nèi)的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，達(dá)到抗氧化的作用［33-35］。張春柳等［36］從鐵皮石斛原球莖中克隆了2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因，分別是DoGAUT1、DoPGSIP6，發(fā)現(xiàn)T1表達(dá)合成多糖，符合次生代謝的積累規(guī)律，P6大量合成胞外多糖。在植物次生代謝中，查爾酮合成酶（CHS）是黃酮類(lèi)化合物合成的第一關(guān)鍵酶［37］；孟衡玲等［38］對(duì)鐵皮石斛中的CHS基因進(jìn)行克隆與分析，發(fā)現(xiàn)該基因在鐵皮石斛的早期參與激素運(yùn)輸和植物器官形態(tài)的形成，在后期主要參與類(lèi)黃酮物質(zhì)的形成；林艷君等［39］采用同源克隆的方法克隆得到鐵皮石斛Do-HDR基因，用滅活的尖孢鐮刀菌菌液作為誘導(dǎo)子，設(shè)置不同的濃度梯度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)子為200mg/L時(shí)，總生物堿的含量達(dá)到最大，可以推測(cè)該基因與鐵皮石斛中生物堿的合成、積累有關(guān)。

3.4參與休眠解除和菌根互作相關(guān)的基因

鐵皮石斛是一種獨(dú)特的菌根植物，在生長(zhǎng)過(guò)程中，真菌會(huì)侵染其根皮層，為鐵皮石斛的生長(zhǎng)提供一定的營(yíng)養(yǎng)支撐，從而促進(jìn)幼苗的萌發(fā)、植株生長(zhǎng)、增強(qiáng)植株的抗性，是提高鐵皮石斛的生長(zhǎng)速率和成活率的關(guān)鍵因素［40］。鐵皮石斛在生長(zhǎng)過(guò)程中幾乎都是與真菌共生的，這種共生關(guān)系伴隨著鐵皮石斛的整個(gè)生活史。楊前宇［41］從11種蘭屬植物分離獲得1450株菌根真菌、從41種石斛屬植物分離獲得1434株菌根真菌，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛的種子與酶胞膠膜菌中CaM和CML所在的基因家族參與生物學(xué)調(diào)控。趙明明等［42］首次從鐵皮石斛種子中分離得到一個(gè)鈣依賴(lài)蛋白激酶（CDPK），數(shù)據(jù)分析顯示DoCDPK1、DoCDPK32-like基因在種子中接菌共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)中均有上調(diào)表達(dá)，可以暗示該基因在種子萌發(fā)、真菌共生等信號(hào)傳導(dǎo)中起著調(diào)控的作用。張崗等［43］利用小菇真菌來(lái)浸染鐵皮石斛根部克隆得到一個(gè)促分裂原活化蛋白激酶基因（DoMPK1），結(jié)果表明：該基因可能參與小菇-鐵皮石斛菌根共生互作。

4轉(zhuǎn)基因研究

1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物，到目前對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的研究已經(jīng)取得了突破性的飛躍。目前報(bào)道的對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、農(nóng)桿菌子房注射法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在水稻、小麥、玉米等植物得到廣泛的應(yīng)用。利用一些分子技術(shù)將外源目的基因插入到受體植物中，通過(guò)篩選和培養(yǎng)來(lái)獲得具有抗性的植株，且轉(zhuǎn)化后的植株具有較穩(wěn)定的遺傳表達(dá)［44］。龔延鋒等［45］對(duì)鐵皮石斛阿拉伯吡喃糖變位酶（DoUAM）進(jìn)行克隆與分析，將目的基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)DoUAM基因與對(duì)照組相比生長(zhǎng)緩慢、葉片較瘦小，以此分析基因可能與植物的發(fā)育有關(guān)。崔波等［46］以鐵皮石斛的原球莖為受體，在摁壓條件下，原球莖在濃度為200μmol/L的乙酰丁香酮菌液中浸染30min，培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)入美羅培南、草甘膦篩選的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化的效率最高，這為研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了幫助。楊雪飛等［47］利用基因槍轟擊類(lèi)原球莖法，將大麥中的抗旱耐鹽堿的基因lea3導(dǎo)入鐵皮石斛中，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物耐鹽等脅迫的能力提高，這為鐵皮石斛新品種的選育邁進(jìn)了一步。陳璐等［48］通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）基因?qū)霟o(wú)菌鐵皮石斛原球莖中，Rubisco基因在植物光合作用的葉綠體中存在，由此發(fā)現(xiàn)該基因?qū)μ岣咧参锏墓夂献饔闷鹬匾饔?。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OD600=0.9，浸染時(shí)間為30min，特美汀（TMT）的濃度為50mg/L，潮霉素（Hyg）濃度為55mg/L時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化率最高。武榮花等［49］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）的反義基因?qū)﹁F皮石斛原球莖進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得出用刀切法來(lái)處理原球莖，在乙酰丁香酮（AS）濃度為100μmol/L、農(nóng)桿菌菌液OD600=0.8條件下，浸染時(shí)間為30min，共培養(yǎng)的時(shí)間為60h，最后接種到含有30mg/LMer和3.0mg/L草甘膦（PPT）的培養(yǎng)基中，遺傳轉(zhuǎn)化的效率最高。

5基因編輯

植物基因功能鑒定和新品種的選育很大程度上離不開(kāi)植物突變體的獲得，通過(guò)自然突變、化學(xué)、物理誘導(dǎo)等方法，出現(xiàn)突變效率低、突變位點(diǎn)隨機(jī)，很難得到確定的突變基因［50］。通過(guò)CRISPR/CAS9編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因編輯作用。在單子葉植物和雙子葉植物抗病性基因改良中，采用CRISPR技術(shù)可以切除入侵病毒和外源DNA，從而達(dá)到保護(hù)自身免受侵害的作用［51］。研究表明鐵皮石斛中的多糖和纖維素含量呈負(fù)相關(guān)，胡淞等［52］為了減少鐵皮石斛中的纖維含量，利用CRISPR/CAS9編輯技術(shù)構(gòu)建敲除載體，獲得Csl4基因突變體，發(fā)現(xiàn)突變體植株能降低鐵皮石斛莖中的纖維素合成。SEP3基因在鐵皮石斛花器官的形成和發(fā)育中起著重要作用，黃鑫等［53］利用CRISPR/CAS9編輯技術(shù)構(gòu)建基因敲除載體，并使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得陽(yáng)性原球莖，這為SEP3基因在鐵皮石斛基因表達(dá)的研究提供了幫助。Kui等［54］基于先前開(kāi)發(fā)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，鑒定了幾種外源性基因表達(dá)的高效啟動(dòng)子，并成功應(yīng)用于CRISPR/CAS9編輯基因組中的內(nèi)源基因。

6結(jié)語(yǔ)與展望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代高通量測(cè)序技術(shù)的開(kāi)發(fā)在鐵皮石斛的分子生物學(xué)研究中起著很大的推動(dòng)作用。然而，由于鐵皮石斛自身的特征和地理分布，加上其分子生物學(xué)研究的團(tuán)隊(duì)力量薄弱、資金投入不足等原因，導(dǎo)致分子生物技術(shù)在鐵皮石斛的應(yīng)用方面存在很多難點(diǎn)。目前利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因克隆等技術(shù)對(duì)鐵皮石斛的功能基因的研究取得了一定的進(jìn)展，但主要集中在對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、脅迫相關(guān)的基因方面，對(duì)其他相關(guān)基因研究甚少。在未來(lái)對(duì)功能基因的研究中，可以充分利用CRISPR/Cas9等編輯技術(shù)，通過(guò)基因編輯關(guān)鍵功能基因來(lái)提高功能基因的表達(dá)，雖然CRISPR/Cas9等編輯技術(shù)存在脫靶等問(wèn)題，但相信隨著對(duì)編輯技術(shù)的不斷研究深入，脫靶等問(wèn)題將會(huì)逐漸完善并得到解決，從而為鐵皮石斛功能基因組的研究提供新的思路。

（責(zé)任編輯：胡吉鳳）

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005.

［2］中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，2004.

［3］丁立起.中華食療本草［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2018.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995.

［5］孫恒，胡強(qiáng)，金航，等.鐵皮石斛化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（11）：225-234.

［6］胡秦佳寶，朱亞雄.鐵皮石斛加工制品研究現(xiàn)狀［J］.保鮮與加工，2019，19（1）：159-164.

［7］周俊輝，鐘雪鋒，蔡丁穩(wěn).鐵皮石斛的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005（1）：23-26.

［8］張?zhí)熘?觀賞藥用植物栽培技術(shù)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2017.

［9］YanL，WangX，LiuH，etal.ThegenomeofDendrobiumofficinaleilluminatesthebiologyoftheimportanttraditionalChineseorchidherb［J］.MolecularPlant，2015，8（6）：922-934.

［10］ZhangGQ，XuQ，BianC，etal.TheDendrobiumcatenatumLindl.genomesequenceprovidesinsightsintopolysaccharidesynthase，floraldevelopmentandadaptiveevolution［J］.ScientificReports，2016，6（1）：1-10.

［11］YangX，ChenZ，YinX，etal.Genome-widesurveyindicatesdiversephysiologicalrolesofDendrobiumofficinalecalcium-dependentproteinkinasegenes［J］.InternationalJournalofMolecularSciences，2022，23（3）：1298.

［12］LiuL，XiangH，SongJ，etal.Genome-wideanalysisofDoSPXgenesandthefunctionofDoSPX4inlowphosphorusresponseinDendrobiumofficinale［J］.FrontiersinPlantScience，2022：13.

［13］宋爭(zhēng)，李潞濱，梁立雄，等.鐵皮石斛phytocyanin基因家族全基因組分析［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2018，31（2）：98-106.

［14］WangYH.Traditionaluses，chemicalconstituents，pharmacologicalactivities，andtoxicologicaleffectsofDendrobiumleaves：areview［J］.JournalofEthnopharmacology，2021，270：113851.

［15］HeC，ZhangJ，LiuX，etal.IdentificationofgenesinvolvedinbiosynthesisofmannanpolysaccharidesinDendrobiumofficinalebyRNA-seqanalysis［J］.PlantMolecularBiology，2015，88（3）：219-231.

［16］NiuZ，ZhuF，F(xiàn)anY，etal.Thechromosome-levelreferencegenomeassemblyforDendrobiumofficinaleanditsutilityoffunctionalgenomicsresearchandmolecularbreedingstudy［J］.ActaPharmaceuticaSinicaB，2021，11（7）：2080-2092.

［17］ChenY，HuB，ZhangF，etal.Cytologicalobservationandtranscriptomecomparativeanalysisofself-pollinationandcross-pollinationinDendrobiumofficinale［J］.Genes，2021，12（3）：432.

［18］ChenJ，YanB，TangY，etal.SymbioticandasymbioticgerminationofDendrobiumofficinale（Orchidaceae）responddifferentlytoexogenousgibberellins［J］.InternationalJournalofMolecularSciences，2020，21（17）：6104.

［19］SenguptaS，MajumderAL.Insightintothesalttolerancefactorsofawildhalophyticrice，Porteresiacoarctata：aphysiologicalandproteomicapproach［J］.Planta，2009，229（4）：911-929.

［20］MunnsR，TesterM.Mechanismsofsalinitytolerance［J］.AnnualReviewofPlantBiology，2008，59：651-681.

［21］仇漢林，屈東海，陳東紅，等.鐵皮石斛PRC2復(fù)合體成員的鑒定及對(duì)脅迫響應(yīng)的表達(dá)分析［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，34（3）：497-505.

［22］高靜，王楠，劉阿萍，等.鐵皮石斛類(lèi)受體激酶DoRLK的基因克隆和分子特征［J］.中草藥，2019，50（21）：5307-5312.

［23］凌鴻，曾旭，郭順星.鐵皮石斛DoLEA2基因的克隆、表達(dá)及功能分析［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52（8）：1337-1344.

［24］劉楚琪，胡睿，王萬(wàn)軍.鐵皮石斛氨基酸通透酶基因（DoAAP2）的克隆及表達(dá)分析［J］.生物學(xué)雜志，2019，36（6）：6-11.

［25］HershkoA，CiechanoverA.Theubiquitinsystem［J］.AnnualReviewofBiochemistry，1998，67（1）：425-479.

［26］YuF，WangH，WangL，etal.Orthoreovirusouter-fiberproteinsaresubstratesforSUMO-conjugatingenzymeUbc9［J］.Oncotarget，2016，7（48）：79814-79827.

［27］馬凌暉，歐景丹，劉榮榮，等.鐵皮石斛泛素結(jié)合酶DoUBC9的克隆鑒定與表達(dá)分析［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，19（13）：2407-2413.

［28］李依民，雷根平，顏永剛，等.鐵皮石斛2個(gè)F家族ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和表達(dá)研究［J］.中草藥，2017，48（15）：3153-3159.

［29］FuchsS，GrillE，MeskieneI，etal.Type2Cproteinphosphatasesinplants［J］.TheFEBSJournal，2013，280（2）：681-693.

［30］SchweighoferA，HirtH，MeskieneI.PlantPP2Cphosphatases：emergingfunctionsinstresssignaling［J］.TrendsinPlantScience，2004，9（5）：236-243.

［31］李依民，李元敏，梁小燕，等.一個(gè)A亞族鐵皮石斛蛋白磷酸酶2C基因的分子特征研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2020，55（14）：1195-1200.

［32］劉亮亮，張娜，黑小斌，等.鐵皮石斛蛋白磷酸酶2A基因的分子克隆研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2018，52（9）：61-64，68.

［33］NgTB，LiuJ，WongJH，etal.ReviewofresearchonDendrobium，aprizedfolkmedicine［J］.AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2012，93（5）：1795-1803.

［34］MengLZ，LvGP，HuDJ，etal.EffectsofpolysaccharidesfromdifferentspeciesofDendrobium（Shihu）onmacrophagefunction［J］.Molecules，2013，18（5）：5779-5791.

［35］FanY，HeXJ，ZhouS，etal.CompositionanalysisandantioxidantactivityofpolysaccharidefromDendrobiumdenneanum［J］.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules，2009，45（2）：169-173.

［36］張春柳，賴(lài)鐘雄.鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆及其在不同晝夜溫差下的表達(dá)分析［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2015，36（3）：456-465.

［37］康亞蘭，裴瑾，劉薇，等.紅花查爾酮合成酶基因的克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)［J］.中草藥，2014，45（16）：2385-2389.

［38］孟衡玲，張薇，盧丙越，等.鐵皮石斛查爾酮合酶基因克隆與表達(dá)分析［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，47（12）：2015-2019.

［39］林艷君，賴(lài)鐘雄.鐵皮石斛HDR基因克隆及真菌誘導(dǎo)子對(duì)其表達(dá)和生物堿含量的影響［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2015，36（4）：680-686.

［40］韓潔，杜琳霖，趙杰宏.石斛屬藥用植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2020，39（3）：41-45.

［41］楊前宇.蘭科菌根真菌多樣性研究及其對(duì)蘭科植物的影響［D］.北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2018.

［42］趙明明，張崗，張大為，等.鐵皮石斛S-腺苷酸脫羧酶基因DoSAMDC1的克隆及特征分析［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（6）：946-952.

［43］張崗，趙明明，宋超，等.鐵皮石斛促分裂原活化蛋白激酶基因DoMPK1的克隆及特征分析［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（12）：1703-1709.

［44］張文惠，曾碧玉，劉福平.蝴蝶蘭基因工程研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（12）：37-40，43.

［45］龔?fù)h，文國(guó)松，趙明富.鐵皮石斛DoUAM基因克隆及轉(zhuǎn)化擬南芥［J］.分子植物育種，2019，17（23）：7733-7743.

［46］崔波，劉佳，王潔瓊，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，49（2）：208-212.

［47］楊雪飛，王瑛，羅建平.鐵皮石斛外源lea3基因的轉(zhuǎn)化及耐鹽性分析［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2010，16（5）：622-626.

［48］陳璐，陶明翠，劉丹，等.Rubisco基因遺傳轉(zhuǎn)化鐵皮石斛的條件篩選與優(yōu)化［J］.分子植物育種，2021，19（23）：7845-7850.

［49］武榮花，康瑩瑩，王潔瓊，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACO反義基因?qū)﹁F皮石斛的遺傳轉(zhuǎn)化［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，30（2）：17-21.

［50］劉耀光，李構(gòu)思，張雅玲，等.CRISPR/Cas植物基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，40（5）：38-49.

［51］羅麗婷，蔣君梅，李向陽(yáng)，等.CRISPR技術(shù)在改良植物抗病性中的應(yīng)用［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2021，40（4）：46-57.

［52］胡淞，田英男，馮壘，等.利用CRISPR/cas9技術(shù)研究鐵皮石斛Csl4基因的功能［J］.分子植物育種，2021，19（8）：2596-2602.

［53］黃鑫，師凱輝，胡淞，等.鐵皮石斛SEP3基因的生物信息學(xué)分析及敲除載體的構(gòu)建［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，48（4）：555-559.

［54］KuiL，ChenH，ZhangW，etal.Buildingageneticmanipulationtoolboxfororchidbiology：identificationofconstitutivepromotersandapplicationofCRISPR/Cas9intheorchid，Dendrobiumofficinale［J］.FrontiersinPlantScience，2017，7：2036.