李紅英　陳萌笛　王政博等

關(guān)鍵詞：構(gòu)樹；內(nèi)參基因；Cd脅迫；熒光定量PCR

中圖分類號：S718.46 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）04-0129-10

構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera（L.）Vent.）為?？疲∕oraceae）構(gòu)屬（Broussonetia）落葉喬木，自然分布于我國大部分地區(qū)和東南亞，是一種典型的鄉(xiāng)土樹種和先鋒植物。其表型性狀和遺傳多樣性豐富，基因組緊湊，常作為木本植物研究的模式材料。因其易繁殖、抗逆性強、生長速度快等優(yōu)點，被廣泛應用于飼料、造紙和植被恢復等領(lǐng)域。此外，構(gòu)樹還具有藥用價值，其類黃酮、多酚、果糖等含量遠高于其它植物，構(gòu)樹中的黃酮衍生物對癌細胞有抑制作用，多酚類物質(zhì)可以抑制冠狀病毒蛋白酶。近年來，有研究證明，構(gòu)樹對重金屬Cd有一定的富集和轉(zhuǎn)運能力，因此，被認為是重金屬污染區(qū)群落恢復的先鋒樹種，其主要通過誘導或增強相關(guān)Cd抗性基因表達，合成功能性基因來應對Cd脅迫。因此，了解關(guān)鍵基因的表達方式將有助于闡明構(gòu)樹Cd脅迫中所涉及的分子機制。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）因其方便快捷、強特異性和高靈敏度等優(yōu)勢，已成為研究基因轉(zhuǎn)錄水平表達量的有效手段。然而，RNA質(zhì)量、cDNA質(zhì)量、樣品稀釋倍數(shù)以及實驗操作準確度等因素都會影響qRT-PCR的準確性，因此，引入適宜的內(nèi)參基因，對目的基因表達量標準化分析至關(guān)重要。理想的內(nèi)參基因是能夠在細胞中穩(wěn)定表達、表達量幾乎不受外界環(huán)境干擾的基因，一般為維持細胞基本生命活動的管家基因（Housekeepergene），如肌動蛋白基因（Actin）、18S核糖體RNA（18S Ribosome RNA）、微管蛋白基因（Tublin）和泛素蛋白基因（Ubiquitin）等；但近年來大量研究證明，隨著物種以及組織器官的差異，管家基因的轉(zhuǎn)錄水平有可能會發(fā)生變化，如在羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.）葉片、莖部以及穗中表達穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因分別是Actin、EF-1a和18S rRNA，而根部表達較為穩(wěn)定的是APRT、18S rRNA。茉莉花（Jasminumsambac（L.）Aiton.）在不同的發(fā)育時期以及不同組織中篩選出的最適內(nèi)參基因也不同。此外，同一植物在不同的環(huán)境下內(nèi)參基因穩(wěn)定性之間也存在差異，如海州常山（Clerodendrum trichotomumThunb.）內(nèi)參基因RPL、AP-2基因在鹽脅迫下表達最穩(wěn)定，干旱脅迫下MDH、AP-2基因表達最穩(wěn)定，而熱脅迫下UBCE2和ACT表達最穩(wěn)定。這說明管家基因只能在特定的組織或處理方式中保持相對穩(wěn)定，因此，應根據(jù)特定的試驗條件來選擇適合的內(nèi)參基因，減少試驗誤差。

本研究以Cd脅迫下構(gòu)樹的根和葉為試驗材料，根據(jù)構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選取了10個候選內(nèi)參基因，并通過qRT-PCR技術(shù)，結(jié)合基因穩(wěn)定性分析軟件geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder在線分析工具，對10個候選內(nèi)參基因在構(gòu)樹Cd脅迫下根和葉片中的表達穩(wěn)定性進行評估，篩選出表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并利用構(gòu)樹逆境脅迫關(guān)鍵基因BpDREB進一步驗證上述結(jié)果的可靠性，為后續(xù)開展構(gòu)樹Cd脅迫響應基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料

構(gòu)樹種子購自江蘇宿遷天橋區(qū)映陽苗木經(jīng)營部，將種子用1600 mg·L^-1的GA3溶液浸泡24 h，蒸餾水沖洗2～3次后播種于草炭土和蛭石混合基質(zhì)中，置于光照培養(yǎng)箱中（溫度30℃，濕度60%，光照12 h，黑暗12 h）培養(yǎng)。培養(yǎng)6個月后，選取長勢良好、大小一致的構(gòu)樹幼苗，參照Xu等實驗設(shè)計并稍作調(diào)整，將幼苗小心剝離營養(yǎng)基質(zhì)后置于1/2霍格蘭營養(yǎng)液中緩苗1周，每3d更換1次，之后加入400 pmol·L^-1CdCl₂進行模擬Cd脅迫處理，分別在處理后0（CK）、3、6、12、24、48、72、96、120 h取其根部與葉片，液氮速凍后放置于-80℃保存，每個取樣時間點均取3個重復。

1.2實驗方法

1.2.1總RNA提取和cDNA第一鏈合成 利用Trizol法（北京聚合美，MF034）提取RNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，使用超微量紫外分光光度計（NanoDrop2000）檢測RNA濃度和純度。利用M5 Super qPCR RTKit（北京聚合美，MF012）完成cDNA第一鏈合成，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計 根據(jù)構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組序列，對選定的10個候選內(nèi)參基因BpUBE2、BpRPL8、BpActin、BpGAPDH、BpHSP、BpTUA、BpDOUB、Bpβ-TUB、BpHIS、BpNADH使用Primer3web （V4.1.0，http：//primer3.ut.ee/）設(shè)計引物，并利用Blast工具檢測引物特異性。引物序列、擴增產(chǎn)物長度和Tm值等詳見表1，引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.2.3 qRT-PCR反應條件 qRT-PCR采用SYBR Green染料法，按照2×M5 HiPer SYBRPremix EsTaq試劑盒（北京聚合美，MF787）說明書配制PCR反應體系為：cDNA棋板1μL，正反向引物（10μmol·L^-1）各0.2 pL，2×M5 HiPerSYBR Premix EsTaq 5μL，用ddH₂O補至10μL。每個樣品均設(shè)置3個重復，利用伯樂公司的CFX96實時熒光定量PCR儀對樣品進行擴增。PCR反應程序：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，39個循環(huán)，熔解曲線：以65℃到95℃，每個循環(huán)增加0.5℃，持續(xù)0.05s獲得解鏈溫度，采集熒光信號。

1.2.4引物特異性及擴增效率檢測 將cDNA樣本等量混合后用ddH2O稀釋1倍作為模板進行普通PCR擴增，用于檢測引物的特異性。反應體系為：14.3 pL ddH₂O，2μL 10×PCR Buffer， 1.6μLdNTP（2.5 mmol.L^-1），

0.1μL rTaq（5U·μL^-1），cDNA1.5μL，上下游物（10μmol·L^-1）各0.25μL。反應程序為95℃2 min；98℃10s，60℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)，72℃5 min，反應結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠進行引物特異性檢測。

將Cd脅迫下所有樣本的cDNA取適量等量混合后稀釋成6個梯度（1/3、1/9、1/27、1/81、1/243、1/729），并以此為模板進行qPCR擴增，用于標準曲線的繪制，并利用公式E=（3^-1/slope-1）×100%計算引物擴增效率。反應體系和程序如1.2.3所述。

1.2.5候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析 通過熒光定量PCR得出10個候選基因在Cd脅迫下構(gòu)樹不同組織中的CT值，使用Microsoft Excel 2016軟件整理原始CT值，并分別采用基于Microsoft Excel 2010的3個基因穩(wěn)定性評價軟件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）和在線分析工具RefFinder（https：//blooge.cn/RefFinder/）對10個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行綜合評價，篩選出構(gòu)樹在Cd脅迫下的最佳內(nèi)參基因。

1.2.6內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證 選擇構(gòu)樹逆境脅迫響應基因Bp DREB用于驗證篩選出的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。以Cd脅迫下構(gòu)樹的cDNA為模板，使用熒光定量PCR技術(shù)，以最佳候選基因及其組合作為標準化因子，以不穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為比較，使用2-AACT法分析Bp DREB基因在構(gòu)樹根部和葉片中的相對表達量，實驗設(shè)置3個重復，反應體系和程序如1.2.3所述。

2結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

RNA樣品濃度為160～287ng.μL^-1，A_260/280的值為2.0～2.2，這表明RNA無蛋白或酚類污染，純度較高。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示：各樣本的RNA主帶清晰，無彌散拖尾現(xiàn)象，且28S rRNA條帶的亮度約為18S rRNA條帶的2倍，這表明RNA無明顯降解，完整性良好，可用于后續(xù)實驗。

2.2引物特異性及擴增效率檢測

以Cd脅迫下構(gòu)樹根和葉等量混合的cDNA為模板進行常規(guī)PCR擴增，結(jié)果（圖2）表明：所有引物目標片段單一明亮，無引物二聚體及非特異性擴增現(xiàn)象，且條帶大小與預期相符。進一步利用qRT-PCR技術(shù)驗證引物特異性，結(jié)果（圖3）表明：各候選內(nèi)參基因的溶解曲線均呈單一溶解峰，說明所用引物都能進行特異性擴增。經(jīng)計算，各候選內(nèi)參基因擴增效率（E）為90.43%～102.81%，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.987～0.999（表1）。以上結(jié)果表明，各候選基因特異性和擴增效率良好，可用于后續(xù)實驗。

2.3內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1內(nèi)參基因CT值分析 C_T值與基因表達量呈反比，CT值越低基因表達水平越高。通過對箱線圖（圖4）進行分析可知：大部分基因C_T值分布在21～28之間，表達豐度適中。此外，由箱線圖跨度可初步判定BpGAPDH（21.59～32.58）的C_T值跨度廣，基因表達穩(wěn)定性較弱，而BpNADH（ 25.86～27.36））、BpDOUB（23.09～25.12）、BpUBE2（21.78～23.67）的C_T值跨度小，基因表達較穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，構(gòu)樹中不同內(nèi)參基因在Cd脅迫下具有不同的表達水平，從C_T值變化跨度推測BpNADH、BpDOUB和BpUBE2表達量較穩(wěn)定，是潛在的最佳候選內(nèi)參基因。

2.3.2 geNorm分析 通過geNorm軟件計算各候選內(nèi)參基因在構(gòu)樹Cd脅迫下不同組織中表達穩(wěn)定性的M值，該軟件是以M=1.5為臨界值，M值越小，則內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越高。geNorm分析結(jié)果（圖5A）表明：在Cd脅迫下構(gòu)樹各候選內(nèi)參基因M值均低于1.5，即各候選內(nèi)參基因表達都相對穩(wěn)定，穩(wěn)定性排序從高到低依次為Bp DOUB（0.35） =BpUBE2（0.35） >BpNADH（0.399）>BpHIS（0.443） >BpActin（0.501） >BpTUA（0.535） >BpHSP（0.567）>BpRPL8（0.666）>Bpβ-TUB（0.776） >BpGAPDH（1.416）.

為確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)量，使用配對變異系數(shù)Vnl（n+1）對10個候選內(nèi)參基因進行分析，Vnl（n+1）的臨界值為0.15，當Vnl（n+1）<0.15時，說明選擇r個基因作為內(nèi)參基因即可保證結(jié)果穩(wěn)定可靠。由圖58可知：本實驗所有樣品的V_2/3<0.15，說明在Cd脅迫下選擇2個基因作為內(nèi)參基因，結(jié)果穩(wěn)定可靠，無需選擇更多基因。

2.3.3 Normfinder分析 NormFinder軟件是根據(jù)表達穩(wěn)定值（S值）對基因的穩(wěn)定性進行排序，S值越小基因表達越穩(wěn)定。NormFinder分析結(jié)果（圖6）表明：在Cd脅迫下，構(gòu)樹的根，葉組織中，10個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排名從高到低依次為：BpDOUB（0.175） >BpNADH（0.208）>BpActin（0.214》BpHIS（0.287）>BpUBE2（0.324） >BpTUA（0.328）>BpHSP（0.740）>Bpβ-TUB（0.815）>BpRPL8（1.246）>BpGAPDH（3.947），即在Cd脅迫下構(gòu)樹中BpDOUB（0.175）和BpNADH（0.208）表達穩(wěn)定性較高，而BpGAPDH（3.947）的穩(wěn)定性最低，不適合作為內(nèi)參基因使用。

2.3.4 BestKeeper分析 Bestkeeper主要是通過比較各候選內(nèi)參基因CT值之間的標準偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）來評價基因的穩(wěn)定性。當SD值<1.0時，即認為該基因表達相對穩(wěn)定。Bestkeeper的分析結(jié)果（表2）表明：BpGAPDH（3.40）>1.0，不適合作為內(nèi)參基因，其余9個候選基因的SD值均<1.0，說明大多數(shù)候選內(nèi)參基因表達較穩(wěn)定，候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排序從高到低依次為：BpNADH（0.32）>BpHIS（0.47）>BpUBE2（0.48）>BpDOUB（0.55）>BpActin（0.61）>BpHSP（0.67）>BpTUA（0.71）>Bpβ-TUB（0.93）>BpRPL8（0.95）>BpGAPDH（3.40），其中，Bp NADH的SD和CV值最?。⊿D=0.32，CV=1.19），穩(wěn)定性最好。

2.3.5 RefFinder分析 為避免單一內(nèi)參基因評價程序引起結(jié)果誤差，通過在線分析工具RefFinder對3個軟件的基因表達穩(wěn)定性排序進行幾何平均值計算，幾何平均值越小，基因的表達穩(wěn)定性越高。結(jié)果（表3）所示，各基因綜合穩(wěn)定性排序從高到低依次為BpDOUB（1.41）>BpNADH（2.34）>BpUBE2 （2.59） >BpHIS （2.83） >BpActin（4.16）>BpTUA （6.24）>BpHSP（6.74）>Bpβ-TUB（8.24）>BpRPL8（8.74）>BpGAPDH（10.00）。說明BpDOUB（1.41）和BpNADH（2.34）表達穩(wěn)定性優(yōu)于其它基因，可作為Cd脅迫下構(gòu)樹qRT-PCR分析首選內(nèi)參基因，而BpGAPDH（10.00）基因表達最不穩(wěn)定，不宜作為Cd脅迫下構(gòu)樹的內(nèi)參基因。

2.3.6內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證 為驗證篩選出的內(nèi)參基因可靠性，采用qRT-PCR技術(shù)對Cd脅迫下BpDREB基因在構(gòu)樹葉片以及根部的表達模式進行研究，使用篩選出的最佳內(nèi)參基因Bp DOUB、BpNADH及其組合BpDOUB+BpNADH作為標準化因子，以最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因BpGAPDH為參照，對BpDREB基因表達水平進行驗證。結(jié)果（圖7）表明：使用不同的內(nèi)參基因得到的Bp DREB表達量之間存在較大差異。分別以穩(wěn)定性好的BpDOUB、BpNADH以及BpDOUB+BpNADH作為內(nèi)參基因時，Bp DREB基因的表達模式一致?？傮w來看，在Cd處理下，構(gòu)樹葉片及根部的BpDREB表達量均呈上調(diào)趨勢，葉片中BpDREB的表達量在96h達到最高點，根部72 h達到最高點；而用最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因BpGAPDH為參照時，會導致完全不同的結(jié)果。因此，不合適的內(nèi)參基因會導致目的基因表達水平偏差，影響實驗的準確性，進一步驗證了以BpDOUB和BpNADH作為內(nèi)參基因的可靠性。

3討論

土壤重金屬污染已成為目前亟待解決的環(huán)境問題之一，Cd是最具威脅的重金屬元素，對植物生長和人體健康都造成嚴重威脅。作為重金屬區(qū)群落恢復的先鋒樹種，構(gòu)樹對重金屬Cd具有極高的富集能力，研究構(gòu)樹抗逆機制，解析其響應Cd的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘構(gòu)樹相關(guān)抗逆基因，有助于闡明構(gòu)樹Cd脅迫適應機制。實時熒光定量PCR是分析基因表達水平和調(diào)控模式的主要手段之一，選擇表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因是準確分析目的基因表達量的前提，以往研究結(jié)果表明，內(nèi)參基因不具有絕對通用性，若不經(jīng)篩選而以常見管家基因為內(nèi)參基因，得到的結(jié)果精確度大幅度降低，甚至得到錯誤結(jié)果。以往構(gòu)樹基因表達研究常直接以Actin為內(nèi)參，可能存在一定誤差。近年來，隨著構(gòu)樹基因組測序的完成和構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平研究的深入，開展構(gòu)樹內(nèi)參基因篩選能夠為后續(xù)功能基因的表達分析提供重要的基礎(chǔ)。

在非模式植物中，結(jié)合植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行內(nèi)參基因篩選是有效的方法之一，目前已在杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.） Hook.）、麥緣錦楸（Catalpa fargesii Bur.）、福建柏（Fokieniahodginsii （Dunn） Henryet Thomas.）等多種植物中應用。有研究發(fā)現(xiàn)，在甘藍型油菜（Brassica napus L.）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫挖掘到的內(nèi)參基因UXS3、SAP5、ARFA IE的表達穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)內(nèi)參基因Actin 7。本研究結(jié)合構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，初步選擇10個常見管家基因作為候選內(nèi)參基因，通過qRT-PCR技術(shù)，并結(jié)合geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對構(gòu)樹Cd脅迫下不同組織器官表達穩(wěn)定性進行評估。由于各軟件的運算邏輯及使用的統(tǒng)計學方法不同，各分析軟件中內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排名略有差異，如geNorm與NormFinder軟件分析結(jié)果均顯示BpDOUB基因表達穩(wěn)定性最好，而Bestkeeper軟件分析結(jié)果則顯示BpNADH基因表達較穩(wěn)定。這種現(xiàn)象在楊樹（Populus deltoides、）、扇脈杓蘭（Cypripedium japoricum Thunb.）以及其它植物內(nèi)參基因研究中也有出現(xiàn)。RefFinder是一種候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性綜合分析的程序，已被廣泛用于內(nèi)參基因篩選研究中。為對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行綜合評價，本研究利用RefFinder對10個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行綜合評估，基因表達穩(wěn)定性從高到低依次為BpDOUB、BpNADH、BpUBE2、BpHIS、BpActin、BpTUA、BpHSP、Bpβ-TUB、BpRPL8、BpGAPDH。為避免單個內(nèi)參基因造成實驗誤差，通常選擇2個或多個基因作為內(nèi)參基因調(diào)整系統(tǒng)偏差，得到更準確的基因表達定量結(jié)果，本研究中用geNorm軟件確定了內(nèi)參基因最佳數(shù)量，各候選內(nèi)參基因的變異系數(shù)（V_2/3）均<0.15，說明在Cd脅迫下構(gòu)樹僅需要2個內(nèi)參基因即可得到可靠結(jié)果。最終確定BpDOUB和BpNADH為Cd脅迫條件下構(gòu)樹熒光定量結(jié)果標準化分析的最佳內(nèi)參基因組合。

DREB是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，植物遭受逆境脅迫后，DREB通過與逆境抗性基因啟動子區(qū)的DRE/CRT（脫水反應元件）順式元件發(fā)生特異性相互作用，調(diào)節(jié)一系列下游基因（包含DRE/CRT元件）的表達，增強植物逆境的抗性，已經(jīng)在構(gòu)樹、甘薯（Dloscorea esculenta（Lour.）Burkill）、剛毛檉柳（Tamarix hispida Willd.）等多種植物研究中發(fā)現(xiàn)DREB基因可以被重金屬Cd誘導上調(diào)表達，可用于驗證篩選出的內(nèi)參基因的可靠性。本研究分別使用篩選出的最佳內(nèi)參基因BpDOUB、BpNADH及其組合為內(nèi)參基因，同時以穩(wěn)定性最差的基因BpGAPDH為參照，分析Cd脅迫下BpDREB基因在構(gòu)樹根部以及葉片中的表達模式，結(jié)果顯示：使用表達穩(wěn)定的基因（BpDOUB、BpNADH）進行基因表達水平歸一化時，逆境脅迫響應基因BpDREB在Cd處理下構(gòu)樹的根部和葉部表達模式基本一致，均為上調(diào)表達，而用不穩(wěn)定的BpGAPDH基因為參照時，基因表達水平明顯不同，進一步驗證了篩選出的內(nèi)參基因的準確性。綜上表明，選擇適合的內(nèi)參基因?qū)τ诜治瞿康幕虮磉_變化至關(guān)重要。

4結(jié)論

本研究通過qRT-PCR技術(shù)并結(jié)合內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評價，確定BpDOUB和BpNADH為構(gòu)樹Cd脅迫條件下最適內(nèi)參基因組合，并通過逆境脅迫響應基因BpDREB進一步驗證篩選的內(nèi)參基因的準確性。本研究結(jié)果為構(gòu)樹Cd脅迫下目的基因表達分析提供了可靠的內(nèi)參基因，為開展構(gòu)樹耐Cd機理研究和重要功能基因發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。