楊福情　敖翔　肖丹丹　劉丙巖　王建勛　宋林

［摘要］ 目的 探究磷酸弗林酸性簇分選蛋白2（PACS-2）對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的心肌肥大的影響及其機制。方法 剪取并消化出生1～2 d的SD大鼠乳鼠的心臟組織，采用差速貼壁法獲取乳鼠心肌細胞（NRCMs），原代培養(yǎng)24 h。以濃度為1.5 μmol/L的AngⅡ處理NRCMs 0、3、6、12、24 h，采用Western blot方法檢測細胞中FUN14域蛋白1（FUNDC1）、PACS-2、三磷酸肌醇受體蛋白（IP3R）的表達水平，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測細胞中心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）mRNA的表達水平。將NRCMs分為A～C組，A組使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，B、C組分別轉染si-NC和si-PACS-2，采用Western blot方法檢測各組細胞中PACS-2蛋白的表達水平。將NRCMs分為D～G組，D組使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，E組以濃度0.15 μmol/L的AngⅡ培養(yǎng)，F(xiàn)、G組分別轉染si-NC、si-PACS-2后再以濃度0.15 μmol/L的AngⅡ培養(yǎng)，采用TRITC-鬼筆環(huán)肽染色技術檢測各組心肌細胞表面積，RT-qPCR檢測各組細胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平，以Fluo-4，AM探針檢測各組細胞胞質(zhì)Ca²⁺的水平。將NRCMs分為H～K組，H組使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，I、J組分別轉染si-NC、si-PACS-2，K組轉染si-PACS-2并且以濃度1 μmol/L的鈣調(diào)蛋白（CaM）拮抗劑處理后，采用RT-qPCR方法檢測各組細胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平。結果 以濃度1.5 μmol/L的AngⅡ處理NRCMs 0、3、6、12、24 h，NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平呈時間依賴性上調(diào)（F=25.73～58.30，P<0.05），并且處理第24小時時相較于第0小時時均顯著上調(diào)（t=5.35～37.50，P<0.05）。以濃度1.5 μmol/L的AngⅡ處理NRCMs 0、3、6、12、24 h，NRCMs中IP3R、PACS-2以及FUNDC1蛋白的表達水平均呈時間依賴性下調(diào)（F=5.37～9.07，P<0.05），并且處理第24小時時相較于第0小時時顯著下調(diào)（t=6.55～7.42，P<0.05）。與B組相比，C組NRCMs中PACS-2蛋白的表達水平顯著下調(diào)（t=5.92，P<0.05）。與F組相比，G組NRCMs中心肌細胞表面積增大，ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平及胞質(zhì)Ca²⁺水平均上調(diào)（t=3.50～26.60，P<0.05）。與J組相比，K組NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表達水平均顯著下調(diào)（t=3.27～5.13，P<0.05）。結論 敲低PACS-2可增加NRCMs中胞質(zhì)Ca²⁺水平，并且可能以Ca²⁺-CaM依賴的方式加重AngⅡ誘導的心肌肥大的發(fā)生。

［關鍵詞］ 磷酸弗林酸性簇分選蛋白2；心臟擴大；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；線粒體膜；鈣；血管緊張素Ⅱ

［中圖分類號］ R541

［文獻標志碼］ A

EFFECT OF PHOSPHOFURIN ACIDIC CLUSTER SORTING PROTEIN 2 ON ANGIOTENSIN Ⅱ-INDUCED CARDIAC HYPERTROPHY AND ITS MECHANISM ＼ YANG Fuqing， AO Xiang， XIAO Dandan， LIU Bingyan， WANG Jianxun， SONG Lin（Department of Biochemistry and Molecular Biology Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of phosphofurin acidic cluster sorting protein 2 （PACS-2） on angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）-induced cardiac hypertrophy and its mechanism. Methods The heart tissue of neonatal Sprague-Dawley rats aged 1-2 d was clipped and digested， and the differential adhesion method was used to obtain neonatal rat cardiomyocytes （NRCMs）， which were primary cultured for 24 h. After NRCMs were treated with 1.5 μmol/L Ang Ⅱ for 0， 3， 6， 12， and 24 h， Western blot was used to measure the protein expression levels of FUN14 domain-containing protein 1 （FUNDC1）， PACS-2， and inositol 1，4，5-trisphosphate receptor （IP3R） in cells， and RT-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of atrial natriuretic peptide （ANP）， brain natriuretic peptide （BNP）， and β-myosin heavy chain （β-MHC） in cells. NRCMs were divided into groups A-C， group A was cultured with serum-free medium， and groups B and C were transfected with si-NC and si-PACS-2， respectively， Western blot was used to measure the protein expression level of PACS-2 in each group. NRCMs were divided into groups D-G， group D was cultured with serum-free medium， group E was cultured with 0.15 μmol/L Ang Ⅱ， and groups F and G were transfected with si-NC and si-PACS-2， respectively， and were then cultured with 0.15 μmol/L Ang Ⅱ， TRITC-phalloidin staining was used to measure the surface area of cardiomyocytes in each group， RT-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of ANP， BNP， and β-MHC in each group， and Fluo-4，AM probe was used to measure the level of cytosolic Ca²⁺in each group. NRCMs were divided into groups H-K， group H was cultured with serum-free medium， groups I and J were transfected with si-NC and si-PACS-2， respectively， and group K was transfected with si-PACS-2 and cultured by 1 μmol/L CaM inhibitor; RT-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of ANP， BNP， and β-MHC in each group. Results After treatment of NRCMs with Ang Ⅱ at a concentration of 1.5 μmol/L for 0， 3， 6， 12， and 24 h， the mRNA expression levels of ANP， BNP， and β-MHC in NRCMs gradually increased over time （F=25.73-58.30，P<0.05）， and the levels at 24 hours of treatment were significantly upregulated compared with those at 0 hour （t=5.35-37.50，P<0.05）. After treatment of NRCMs with Ang Ⅱ at a concentration of 1.5 μmol/L for 0， 3， 6， 12， and 24 h， the protein expression levels of IP3R， PACS-2， and FUNDC1 in NRCMs gradually decreased over time （F=5.37-9.07，P<0.05）， and the levels at 24 h of treatment were significantly downregulated compared with those at 0 h （t=6.55-7.42，P<0.05）. Compared with group B， group C had a significant reduction in the protein expression level of PACS-2 in NRCMs （t=5.92，P<0.05）. Compared with group F， group G had significant increases in the surface area of cardiomyocytes， the mRNA expression levels of ANP， BNP， and β-MHC， and the level of cytosolic Ca²⁺in NRCMs （t=3.50-26.60，P<0.05）. Compared with group J， group K had significant reductions in the mRNA expression levels of ANP， BNP， and β-MHC in NRCMs （t=3.27-5.13，P<0.05）. Conclusion Knockdown of PACS-2 can increase the level of cytosolic Ca²⁺in NRCMs and aggravate Ang Ⅱ-induced cardiac hypertrophy in a Ca²⁺-CaM-dependent manner.

［KEY WORDS］ Phosphofurin acidic cluster sorting protein 2; Cardiomegaly; Endoplasmic reticulum; Mitochondrial membranes; Calcium; Angiotensin Ⅱ

病理性心肌肥大是由各種損傷刺激因子和持續(xù)壓力負荷引起的代償性心臟擴張^[1]。長期病理性心肌肥大是心肌梗死、心律失常、心力衰竭甚至猝死的重要原因^[2]。病理性心肌肥大的發(fā)病機制之一是心肌細胞Ca²⁺動態(tài)紊亂，而胞質(zhì)中Ca²⁺超載能激活Ca²⁺依賴相關肥大信號通路^[3-4]。線粒體相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAMs）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和線粒體之間的動態(tài)膜結構^[5]，與細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及線粒體穩(wěn)態(tài)等密切相關^[6-7]。大量研究表明MAMs異常與多種心血管疾病有關^[8]。磷酸弗林酸性簇分選蛋白2（PACS-2）作為MAMs上的結構蛋白，通過影響線粒體分裂調(diào)節(jié)MAMs的形成^[9]。然而，PACS-2在心肌肥大中的作用機制尚不是很清楚。本研究旨在探討敲低乳鼠心肌細胞（NRCMs）中的PACS-2對AngⅡ誘導的心肌肥大的影響，為預防和治療心肌肥大甚至心力衰竭提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料

SD大鼠乳鼠購自青島大任富城畜牧公司；胞質(zhì)鈣離子探針（Fluo-4，AM）購自上海翌圣生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRITC標記鬼筆環(huán)肽染料購自北京索萊寶科技有限公司；FUN14域蛋白1（FUNDC1）、PACS-2、三磷酸肌醇受體蛋白（IP3R）兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；鈣調(diào)蛋白（CaM）拮抗劑購自美國MCE公司；PACS-2小干擾RNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞提取和培養(yǎng) 將30只出生1～2 d的SD大鼠乳鼠置于無菌玻璃皿當中，使用體積分數(shù)0.75的乙醇清洗2次，無菌條件下解剖分離乳鼠心臟，PBS緩沖液（pH 7.4）清洗；切碎并置于1.2 g/L胰液素和0.14 g/LⅡ型膠原酶配制的消化液中；消化后的細胞懸液在37 ℃下孵育1 h，上清液即為NRCMs。將稀釋至1×10⁹個/L的NRCMs接種于含有DMEM-F12培養(yǎng)基的孔板（含體積分數(shù)0.05 FBS，10 g/L的青鏈霉素混合液）中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測細胞中心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）mRNA的表達水平 將經(jīng)過分離的NRCMs接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細胞匯合度約達70%時，再經(jīng)無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h后，于培養(yǎng)基中加入濃度1.5 μmol/L的AngⅡ，分別培養(yǎng)0、3、6、12、24 h后，采用Trizol法提取細胞的總RNA，NanoDrop分光光度計測定RNA的濃度與純度。按照反轉錄試劑盒說明書步驟將1 μg RNA反轉錄為cDNA，繼而以此為模板進行RT-qPCR。采用2^－△△CT方法來計算目的基因的相對表達量。ANP、BNP、β-MHC 以GAPDH為內(nèi)參照，引物名稱及其序列見表1。

1.2.3 Western blot方法檢測細胞中IP3R、PACS-2、FUNDC1蛋白表達水平 按1.2.2中的方法將NRCMs培養(yǎng)0、3、6、12、24 h后，每孔中加入RIPA裂解液，冰上靜置10 min，提取細胞總蛋白。蛋白樣品以含150 g/L的分離膠以及50 g/L濃縮膠的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉膜1.5 h，并使用含體積分數(shù)0.05的脫脂牛奶封閉1 h。封閉結束后，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，使用超敏ECL發(fā)光液顯影。使用Image J軟件分析相關蛋白的灰度值，以β-Actin為內(nèi)參照，目的蛋白的相對表達水平以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值計算，作為NRCMs中IP3R、PACS-2、FUNDC1蛋白的相對表達水平。

1.2.4 Western blot方法檢測A～C組轉染后的NRCMs細胞中PACS-2蛋白的表達水平 將分離的NRCMs接種于6孔板培養(yǎng)24 h，匯合度約70%時，經(jīng)無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h后，分為A～C組。A組使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，B、C組分別用Lipofectamine^TM3000轉染試劑將si-NC（B組）和si-PACS-2（C組）轉染NRCMs，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)18 h后提取細胞總蛋白，采用Western blot方法檢測A～C組NRCMs細胞中PACS-2蛋白的表達水平。

1.2.5 TRITC-鬼筆環(huán)肽染色檢測D～G組細胞骨架大小 將分離的NRCMs接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，匯合度約達50%時，經(jīng)無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h后，分為D～G組。D組使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；E組培養(yǎng)基中加入濃度0.15 μmol/L的AngⅡ培養(yǎng)24 h；F、G組分別轉染NRCMs si-NC、si-PACS-2并培養(yǎng)24 h后，于培養(yǎng)基中均加入濃度0.15 μmol/L的AngⅡ培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后各組去除原培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，按TRITC-鬼筆環(huán)肽染色試劑盒說明書要求，加入TRITC-鬼筆環(huán)肽（100 nmol/L）工作液，37 ℃下避光孵育30 min，并用雙光子共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）觀察細胞骨架。用Image J軟件測量F-肌動蛋白染色細胞的表面積。

1.2.6 RT-qPCR方法檢測D～G組細胞中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平 取6孔板中培養(yǎng)48 h的D～G組NRCMs，RT-qPCR方法檢測D～G組細胞中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平，3種基因均以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.2.7 Fluo-4，AM檢測D～G組細胞胞質(zhì)中Ca²⁺的水平 取6孔板當中培養(yǎng)48 h以后的D～G組NRCMs，按照Fluo-4鈣離子檢測試劑盒說明書要求，去除原培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，加入Fluo-4，AM（2 μmol/L）工作液，37 ℃下避光孵育30 min，并通過倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）觀察。用Image J軟件分析細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度，以此代表細胞胞質(zhì)中Ca²⁺的水平。

1.2.8 RT-qPCR方法檢測H～K組細胞中ANP、BNP以及β-MHC mRNA的表達水平 將分離后的NRCMs接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，匯合度約達70%時，經(jīng)無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h以后，分為H～K組。H組使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；I、J組分別轉染NRCMs si-NC、si-PACS-2并且培養(yǎng)24 h；K組培養(yǎng)基中加入濃度1 μmol/L的CaM拮抗劑，培養(yǎng)24 h后轉染si-PACS-2后再培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束以后，采用RT-qPCR方法檢測H～K組細胞中的ANP、BNP、β-MHC mRNA表達水平，3種基因均是以GAPDH為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用Graph Pad Prism 8.01軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗均重復3次，結果取均值。計量資料以x?±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AngⅡ對NRCMs相關基因和蛋白表達影響

以濃度為1.5 μmol/L的AngⅡ處理NRCMs 0、3、6、12及24 h以后，NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義（F=25.73～58.30，P<0.05）。其中在加入1.5 μmol/L的AngⅡ處理NRCMs第6、12、24小時時相較于處理第0小時時，上述3種肥大基因表達水平差異有顯著性（t=4.46～37.50，P<0.05）。見表2。選擇以上肥大基因在AngⅡ處理NRCMs第24小時時差異最顯著（P值最?。r間點進行后續(xù)實驗。

以濃度為1.5 μmol/L的AngⅡ處理NRCMs 0、3、6、12、24 h后，NRCMs中IP3R、PACS-2以及FUNDC1蛋白的表達水平比較差異均具有顯著性（F=5.37～9.07，P<0.05）；其中加入1.5 μmol/L的AngⅡ處理NRCMs第24小時時相較于處理第0小時時，上述3個指標進行比較，差異均具有顯著性（t=6.55～7.42，P<0.05）。見表2。

2.2 A～C組NRCMs中PACS-2蛋白相對表達量比較

Western blot檢測結果顯示，A～C組NRCMs當中PACS-2蛋白的表達水平分別為1.00±0.00、0.94±0.06和0.57±0.12，各組比較差異有顯著性（F=24.40，P<0.05）；與B組相比，C組中PACS-2蛋白的表達水平顯著降低（t=5.92，P<0.05）。

2.3 D～G組NRCMs的細胞表面積以及ANP、BNP、β-MHC? mRNA的表達水平比較

經(jīng)AngⅡ和轉染si-PACS-2處理后，D～G組NRCMs的細胞表面積比較差異均具有顯著性（F=679.4，P<0.05），其中與E、F組進行比較，D、G組NRCMs的細胞表面積差異具有顯著性（t=11.92～26.52，P<0.05）。見圖1。

D～G組NRCMs中ANP、BNP以及β-MHC mRNA的表達水平比較差異均具有顯著意義（F=12.55～42.96，P<0.05）。與D組相比較，E、F組NRCMs中上述3種肥大基因的表達水平差異無顯著性（P＞0.05）；與E組相比，F(xiàn)組NRCMs中上述3種肥大基因的表達水平差異無顯著性（P＞0.05）；與E、F組相比，G組NRCMs中上述3種肥大基因的表達水平差異具有顯著性（t=2.74～15.18，P<0.05）。見表3。

2.4 D～G組NRCMs中胞質(zhì)Ca²⁺水平比較

Fluo-4，AM檢測結果顯示，D～G組NRCMs中Ca²⁺相對表達水平分別為1.00±0.07、1.91±0.24、1.98±0.23和2.61±0.25，各組NRCMs中胞質(zhì)Ca²⁺水平比較差異顯著（F=29.51，P<0.05）。與E、F組相比，D、G組NRCMs中胞質(zhì)Ca²⁺水平差異具有顯著性（t=5.35～8.25，P<0.05）；與E組相比，F(xiàn)組NRCMs中胞質(zhì)Ca²⁺水平差異無顯著性（P＞0.05）。

2.5 H～K組NRCMs中的ANP、BNP以及β-MHC mRNA表達水平比較

經(jīng)過轉染si-PACS-2以及以CaM蛋白抑制劑（1 μmol/L）處理NRCMs后，H～K組NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表達水平比較差異均有顯著性（F=14.69～18.69，P<0.05）；與J組相比，H、I、K組NRCMs中上述3種肥大基因的表達水平差異具有顯著性（t=3.27～8.31，P<0.05）；與H組進行比較，I組NRCMs中上述3種肥大基因的表達水平比較差異均無顯著意義（P＞0.05）。見表4。

3 討論

心肌肥大是心肌由于各種因素引起的機械負荷增加而產(chǎn)生的代償性反應，其可逐漸發(fā)展為失代償性，導致不可逆轉的心力衰竭甚至猝死^[10-11]。因此

表4 H～K組心肌肥大基因的相對表達水平的比較（n=3，x?±s）分組ANP mRNABNP mRNAβ-MHC mRNAH組1.00±0.301.00±0.091.00±0.14I組0.96±0.150.91±0.141.20±0.23J組2.44±0.391.92±0.212.27±0.44K組1.16±0.381.30±0.250.91±0.11

預防和逆轉心肌肥大對于心血管疾病的治療具有重要臨床意義。

MAMs作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的關鍵接觸位點，對細胞生理功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MAMs異常與缺血再灌注、心力衰竭等多種心血管疾病有關^[12-13]。MAMs富集多種連接和功能蛋白，如FUNDC1、PACS-2及IP3R等^[14-15]。FUNDC1與IP3R蛋白結合形成連接ER和線粒體的橋梁，參與MAMs的形成^[16]。此外，PACS-2作為一種新的分選蛋白，參與ER和線粒體之間的結合^[7]。本研究將NRCMs經(jīng)濃度1.5 μmol/L的AngⅡ處理0、3、6、12、24 h，RT-qPCR和Western blot方法檢測結果顯示，心肌肥大基因ANP、BNP、β-MHC的表達水平均呈時間依賴性上調(diào)，其中各肥大基因在AngⅡ處理NRCMs第24小時時相比處理第0小時時差異最顯著。同時，IP3R、FUNDC1、PACS-2蛋白的表達水平均呈現(xiàn)了時間依賴性下調(diào)，其中PACS-2蛋白的表達水平在AngⅡ處理24 h后下調(diào)最為明顯。以上的結果均表明，AngⅡ處理能抑制NRCMs中MAM相關蛋白的表達，誘導心肌肥大。真核細胞內(nèi)存在多種蛋白降解的途徑，包括泛素化降解、細胞自噬以及非編碼RNA靶向導致的降解等，探究PACS-2蛋白在心肌肥大中下降的機制及其具體的調(diào)控機制，對于心肌肥大發(fā)病機制及其新的治療方案的研究至關重要。PACS-2作為MAMs的關鍵結構蛋白之一，其缺失會破壞MAMs結構和功能完整性^[17-18]。本研究中以高濃度（1.5 μmol/L）的AngⅡ處理NRCMs以后，心肌肥大基因ANP、BNP、β-MHC的表達水平均呈時間依賴性上調(diào)，并且細胞質(zhì)中PACS-2蛋白呈現(xiàn)時間依賴性下調(diào)，提示PACS-2蛋白是心肌肥大的負調(diào)節(jié)劑。為了進一步探究PACS-2的功能，本研究通過轉染si-PACS-2以敲低NRCMs中PACS-2基因的表達，并采用低濃度（0.15 μmol/L）AngⅡ處理NRCMs，以說明敲低PACS-2對NRCMs發(fā)生心肌肥大的敏感性的影響。NRCMs經(jīng)轉染si-PACS-2 24 h后，給予低濃度0.15 μmol/L 的AngⅡ處理24 h以后，分別進行TRITC-鬼筆環(huán)肽染色以及RT-qPCR檢測，結果顯示，低濃度的AngⅡ就可以促進NRCMs細胞表面積增大，但是敲低PACS-2能夠促進AngⅡ誘導的NRCMs細胞表面積明顯增大；同時，低濃度AngⅡ對NRCMs中ANP、BNP、β-MHC基因表達無顯著影響，而敲低PACS-2能促進AngⅡ誘導這3種心肌肥大基因的表達明顯上調(diào)。以上結果說明，敲低PACS-2可提高NRCMs對AngⅡ誘導的心肌肥大的敏感性。

病理性心肌肥大的發(fā)病機制極其復雜，在病理性肥大的心臟中常常出現(xiàn)線粒體功能障礙、纖維化增加以及Ca²⁺穩(wěn)態(tài)失調(diào)^[1，19]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的Ca²⁺轉移需要PACS-2進行介導，而PACS-2的下降能導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞漿釋放Ca²⁺增加^[7，18]。因此，敲低PACS-2提高NRCMs對AngⅡ誘導的心肌肥大的敏感性的具體機制可能涉及細胞中的Ca²⁺穩(wěn)態(tài)失調(diào)。本研究針對NRCMs轉染si-PACS-2再培養(yǎng)24 h后，給予低濃度AngⅡ處理24 h，行Fluo-4，AM染色，結果顯示，低濃度AngⅡ能促進NRCMs胞質(zhì)Ca²⁺水平顯著增加，而敲低PACS-2使得這種現(xiàn)象更為明顯。該結果說明了敲低PACS-2提高了NRCMs對于AngⅡ誘導的胞質(zhì)Ca²⁺增加的敏感性。在心肌肥大早期，PACS-2的下降能誘導半胱氨酸蛋白酶8水解B細胞受體相關蛋白31產(chǎn)生p20亞基，而后者引起Ca²⁺從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到線粒體中^[20]。本研究通過敲低NRCMs中PACS-2的表達，檢測到的NRCMs胞質(zhì)Ca²⁺水平顯著增加，這種現(xiàn)象可能發(fā)生于心肌肥大晚期。因此，檢測心肌肥大不同時期時細胞內(nèi)Ca²⁺水平，可以揭示在心肌肥大整個的發(fā)病過程中，PACS-2對細胞內(nèi)Ca²⁺調(diào)節(jié)的具體機制。研究表明PACS-2參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間Ca²⁺的運輸，可能與其介導的載貨蛋白的膜運輸有關^[21]。因此，后續(xù)應該進一步研究在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間PACS-2介導的Ca²⁺轉運的具體過程，從而了解PACS-2在心肌肥大中的調(diào)控機制。

胞質(zhì)Ca²⁺是參與心肌肥大的重要信號分子，主要通過兩種信號轉導通路機制誘導核內(nèi)肥大基因轉錄，包括鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ-組蛋白去乙酰化酶通路、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細胞核因子（NFAT）通路等^[22-23]。有研究報道，G蛋白偶聯(lián)受體激酶5能以Ca²⁺-CaM依賴的方式激活NFAT，促進肥大基因的轉錄^[24-25]。因此推測敲低PACS-2也以同樣的方式參與了心肌肥大的發(fā)生。本研究針對NRCMs給予CaM拮抗劑處理24 h后，AngⅡ（0.15 μmol/L）處理24 h，RT-qPCR檢測結果顯示，敲低PACS-2能促進ANP、BNP、β-MHC心肌肥大基因的上調(diào)，而CaM拮抗劑抑制了這種現(xiàn)象。以上結果說明，敲低PACS-2可以Ca²⁺-CaM依賴的方式介導心肌肥大的發(fā)生。

綜上所述，敲低PACS-2能增加NRCMs中胞質(zhì)Ca²⁺水平，并且是以Ca²⁺-CaM依賴的方式加重AngⅡ誘導的心肌肥大的發(fā)生。但是PACS-2如何通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)Ca²⁺發(fā)揮心臟保護作用還需要進一步探究。本研究為心肌肥大及持續(xù)性心肌肥大導致的心血管疾病預防和治療提供了有效實驗數(shù)據(jù)。

作者聲明：楊福情、敖翔、肖丹丹、劉丙巖參與了研究設計；楊福情、王建勛、宋林參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強）