倪可雯，孫瑞健，徐大鳳，于雯雯，周堂建，陳淑吟*

（1.水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)試驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海海洋大學(xué)，上海 201306；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007）

水溫是開展魚類人工養(yǎng)殖必須監(jiān)測的指標(biāo)[1-3]，直接影響著魚類生長發(fā)育。水溫變化易引起魚體的生理應(yīng)激反應(yīng)[4-5]，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧（ROS）過量產(chǎn)生，造成機(jī)體損傷[6-8]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等是水生動(dòng)物清除ROS 的關(guān)鍵酶類[9-10]，魚類通過提高這些抗氧化酶活力來應(yīng)對(duì)包括水溫脅迫在內(nèi)的外部壓力，因而這些酶活的變化，可反映魚類機(jī)體受損或應(yīng)對(duì)脅迫的情況[11]。在對(duì)中華鱘（Acipenser sinensis）[12]、四指馬鲅（Eleutheronematetradactylum）[13]、云紋石斑魚（Epinephelusmoara）[14]等魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度變化超過一定范圍，均顯著影響魚的SOD、CAT 等抗氧化酶活性。堿性磷酸酶（AKP）、血清溶菌酶（LZM）等是魚類重要的免疫相關(guān)酶[15]。河豚（Takifugu obscurus）在水溫25 ℃降至13 ℃過程中，AKP 活性顯著降低[16]；不同品系羅非魚（Oreochromis mossambicus）在水溫26 ℃降至20 ℃過程中，LZM 活性顯著上升，且不同品系間的酶活變化存在差異[17]。這些酶活水平的變化態(tài)勢，直接反映了魚體對(duì)水溫變化的適應(yīng)能力及物種特異性。因此，研究水溫脅迫下魚類相關(guān)酶活指標(biāo)的變化，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)作用。

黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）隸屬于鯛科（Sparidae），棘鯛屬（Acanthopagrus），俗稱黑加吉、黑立，是我國南北沿海均可養(yǎng)殖的重要海水經(jīng)濟(jì)魚類[18]。黑鯛作為沿岸性魚類，有著較廣的適溫范圍[19]，但在長江以北養(yǎng)殖時(shí)，仍無法在室外越冬，須移入室內(nèi)。此外，近年來極端高溫天氣頻發(fā)，影響著魚類的正常生長[20]以及產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[21]。黑鯛適溫范圍廣，是優(yōu)良新種質(zhì)創(chuàng)制的重要性狀指標(biāo)。為此開展了不同水溫對(duì)不同選育品系黑鯛肝臟抗氧化及免疫因子的影響試驗(yàn)，以期為黑鯛養(yǎng)殖技術(shù)提升和新品系選育研究等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚來自江蘇省海水增養(yǎng)殖技術(shù)與種苗中心。5 個(gè)黑鯛品系分別為選育系1（XY1），體長均值為（9.68.±0.70）cm，體質(zhì)量均值為（35.15±8.43）g；選育系2（XY2），體長均值為（10.14±1.35）cm，體質(zhì)量均值為（39.65±12.94）g；山東群體選育系（XY3），體長均值為（10.89±1.13）cm，體質(zhì)量均值為（47.90±13.30）g；福建野生群體子一代（YS），體長均值為（10.01±1.16）cm，體質(zhì)量均值為（36.24±10.67）g；黑鯛♀×真鯛♂雜交子二代新品系（HF2），體長均值為（9.92±0.57）cm，體質(zhì)量均值為（33.36±5.08）g。

1.2 試驗(yàn)方法

設(shè)置降溫組和升溫組，其中降溫組溫度梯度為17（對(duì)照組），13，9 和5 ℃；升溫組溫度梯度為26（對(duì)照組），30，34 和38 ℃。每組再根據(jù)放養(yǎng)的品系分為5 個(gè)黑鯛品系組（XY1、XY2、XY3、YS 和HF2）。各組均設(shè)置3 個(gè)平行，每個(gè)平行分別放養(yǎng)試驗(yàn)魚30 尾，養(yǎng)殖條件一致。

各試驗(yàn)組在對(duì)照組溫度下暫養(yǎng)一周后取樣并開始試驗(yàn)，在達(dá)到設(shè)置溫度養(yǎng)殖12 h 后，隨機(jī)取3 尾魚肝臟，迅速放入液氮，后移至-80 ℃冰箱保存，用于酶活性測定?？偝趸锲缁福═-SOD）、CAT、LZM 和AKP 等酶活性檢測所用試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，試驗(yàn)操作嚴(yán)格參照說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2019 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。采用SPSS19 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)魚存活及酶活性的影響進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），通過Duncan 法比較組間差異，若P＜0.05，則為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛存活率

水溫為9~34 ℃時(shí)，5 個(gè)品系的存活率均超過90%；其中13~26 ℃是黑鯛最適溫度，各品系的存活率接近100%；水溫為5 ℃時(shí)，品系的存活率有所下降，均低于90%；水溫為38 ℃時(shí)，各品系黑鯛存活率均較低，其中存活率最高的HF2品系，也僅為16.9%，YS 品系存活率則最低（表1）。

表1 不同溫度黑鯛5 個(gè)品系存活率 %

2.2 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性

降溫組中，水溫為17 ℃時(shí)，5 個(gè)品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性沒有明顯差異（P＞0.05）。隨著水溫下降，XY1、XY2 和YS 的T-SOD 酶活性先升后降，其中XY1、XY2 在9 ℃時(shí)酶活水平達(dá)到最大值，YS 品系在13 ℃時(shí)酶活水平達(dá)到最大值。XY3和HF2的T-SOD 酶活性則表現(xiàn)為隨著水溫下降而逐漸升高。XY3 和HF2在水溫為5 ℃時(shí)，TSOD 酶活性顯著高于XY1 和YS（P＜0.05），見圖1（a）。

升溫組中，隨著水溫升高，5 個(gè)品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在水溫為30 ℃時(shí)均達(dá)到最大值，且顯著高于其他溫度組（P＜0.05）。就不同品系黑鯛而言，在相同水溫下，5 個(gè)品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性有所差異。其中在水溫為26 ℃時(shí)，XY3 的T-SOD 酶活性顯著高于其余4 個(gè)品系（P＜0.05），在水溫為30 和34 ℃時(shí)，XY3 和HF2的T-SOD 酶活性均顯著高于其他3 個(gè)品系（P＜0.05）；在水溫為38 ℃時(shí)，XY3的T-SOD 酶活性顯著高于另4 個(gè)品系（P＜0.05），見圖1（b）。

圖1 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛肝臟酶T-SOD 活性

2.3 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛肝臟CAT 酶活性

降溫組中，5 個(gè)品系黑鯛肝臟CAT 酶活性均呈先上升后下降的趨勢。在水溫為9 ℃時(shí)，各品系CAT 酶活性均達(dá)到最大值，且均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中XY2 的CAT 酶活性最高，且顯著高于XY1、XY3 和HF2（P＜0.05），XY3 的CAT 酶活性最低，且顯著低于其他4 個(gè)品系（P＜0.05）。水溫降至5 ℃時(shí)，各品系CAT 酶活性出現(xiàn)降低，但顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖2（a）。

圖2 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛肝臟酶CAT 活性

升溫組中，5 個(gè)品系黑鯛肝臟CAT 酶活性隨水溫升高也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。除了YS 的CAT 酶活性在水溫為30 ℃時(shí)最高，其余4 個(gè)品系CAT 酶活性均在水溫為34 ℃時(shí)最高。水溫升之38 ℃時(shí)，5 個(gè)品系的酶活性均出現(xiàn)較大降幅，除了HF2外，其余品系CAT 酶活性均最低，見圖2（b）。

2.4 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛肝臟AKP 酶活性

降溫組中，隨水溫的降低，5 個(gè)品系黑鯛肝臟AKP 酶活性的變化趨勢有所不同。其中XY1、XY2和YS 的AKP 酶活性呈先升高后降低的趨勢，且均在水溫為9 ℃時(shí)最高，水溫為17 ℃時(shí)最低。XY3和HF2則呈升高趨勢，且均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在水溫為17，13 和9 ℃時(shí)，不同品系黑鯛肝臟AKP 酶活性差異不顯著，在水溫為5 ℃時(shí)，XY3 的AKP 酶活性最高，顯著高于XY2 和YS，見圖3（a）。

升溫組中，隨水溫的升高5 個(gè)品系黑鯛肝臟AKP 酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中XY1、XY2 和XY3 的AKP 酶活性均在34 ℃時(shí)最高，YS 和HF2的AKP 酶活性均在30 ℃時(shí)最高。在對(duì)照組中，XY2 的AKP 酶活性最高，與YS 和HF2差異顯著（P＜0.05），與XY1 和XY3 差異不顯著（P>0.05），見圖3（b）。

2.5 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛肝臟LZM 酶活性

降溫組中，隨水溫的下降，5 個(gè)品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均呈先上升后下降的趨勢，其均在水溫為13 ℃時(shí)最高，且差異顯著（P＜0.05），在水溫為5 ℃時(shí)最低。同一溫度下，5 個(gè)品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均有所差異，但沒有明顯趨勢，見圖4（a）。

升溫組中，隨水溫的升高，YS 的LZM 酶活性先升高后降低，其余4 個(gè)品系則均呈上升趨勢。YS 的LZM 酶活性在水溫為30 ℃最高，但其隨水溫的升高下降不顯著（P>0.05）。其余各品系在水溫為38 ℃最高，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。同一溫度下，5 個(gè)品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均有所差異，但沒有明顯趨勢，見圖4（b）。

圖4 不同水溫5 個(gè)品系黑鯛肝臟酶LZM 活性

3 討論

3.1 溫度變化對(duì)5 個(gè)品系黑鯛T-SOD 和CAT 活性的影響

魚類體溫每改變1 ℃，其體內(nèi)的許多生理過程的效率會(huì)改變6%~10%[22]。溫度變化影響到魚體內(nèi)的各種代謝，包括肝臟的抗氧化體系[23-24]?？寡趸富钚缘淖兓谝欢ǔ潭壬峡煞从臭~體的生理狀況，可作為衡量魚類對(duì)外界環(huán)境適宜程度的重要生理指標(biāo)[25]。SOD 是生物體內(nèi)清除氧自由基（ROS）的首要物質(zhì)，能催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2的反應(yīng)。CAT 是清除H2O2的酶，與SOD 協(xié)同維持生物體內(nèi)氧自由基含量的穩(wěn)定平衡[26]。正常情況下，魚類面臨溫度脅迫時(shí)，通過調(diào)控升高體內(nèi)SOD 和CAT 酶活性，對(duì)抗與阻斷因應(yīng)激導(dǎo)致的氧自由基增加，以抵抗不良環(huán)境[27]。黃姑魚（Nibeaalbiflora）[28]、卵形鯧鲹（Trachinotusovatus）[29]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）及硬頭鱒（Steelhead, Salmon Gairdneri）[30]等體內(nèi)的SOD 和CAT 等抗氧化酶活性，在受到水溫變化的脅迫時(shí)，均顯著升高。環(huán)境脅迫超過機(jī)體的承受能力時(shí)，酶活性則不僅無法再升高，而且還會(huì)出現(xiàn)下降趨勢，如白梭吻鱸（Sander lucioperca）在36 ℃時(shí)，其SOD 及CAT 活性開始下降[31]；大口黑鱸（Micropterus salmoides）在31 ℃時(shí)CAT 活性開始下降[32]。

本試驗(yàn)降溫組中，XY3 和HF2的T-SOD 酶活性隨水溫的降低逐漸升高，其余品系則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中，YS 的T-SOD 酶活性在13 ℃時(shí)達(dá)到最大值，XY1 和XY2 在9 ℃時(shí)T-SOD 活性值最大。因此，XY3 和HF2在5 ℃時(shí)能較好地適應(yīng)，且其耐受更低水溫。CAT 酶活性的變化與T-SOD有所不同及滯后，各品系均在9 ℃時(shí)達(dá)到最大酶活。水溫為5 ℃時(shí)，5 個(gè)品系的T-SOD 和CAT 酶活性均高于對(duì)照組，且存活率均>80%，因此5 個(gè)品系在水溫為5 ℃時(shí)均有較強(qiáng)耐受能力。

升溫組中，水溫升高到30 ℃時(shí)，5 個(gè)品系T-SOD酶活性均達(dá)到最大值，XY2 和YS 的CAT 酶活性也達(dá)到最大值。因此，若水溫繼續(xù)升高，這2 個(gè)品系抗氧化酶活性將不能提高，進(jìn)而消除ROS 增加所帶來的損傷。XY1、XY3 和HF2的CAT 酶活性則在34 ℃達(dá)到最大值。水溫升至38 ℃后，各品系死亡率均急劇上升，均超過80%，該水溫下T-SOD 和CAT 酶活性也均出現(xiàn)大幅下降。一般而言，酶促反應(yīng)的適溫范圍要大于魚類正常的生存溫度范圍[22]，因此，認(rèn)為34 ℃水溫已是大部分黑鯛的承受極限。但各品系中均有部分個(gè)體可耐受38 ℃水溫，其中XY3 和HF2存活率高于其他品系。

3.2 溫度變化對(duì)5 個(gè)品系黑鯛AKP 和LZM 活性的影響

AKP 是生物體免疫功能和健康狀況的參考指標(biāo)[33]，也是評(píng)價(jià)動(dòng)物生理代謝水平的一項(xiàng)重要參數(shù)[34]。本試驗(yàn)的降溫組中，隨著水溫的降低，XY3 和HF2的AKP 酶活性逐漸升高，其余3 個(gè)品系則呈先升高后降低的趨勢，且均在水溫為9 ℃時(shí)最高，水溫為17 ℃時(shí)最低。升溫組中，隨水溫的升高，5 個(gè)品系A(chǔ)KP 酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在美洲黑石斑（Centropristis striata）幼魚[35]、施氏鱘（Acipenser Schrenckii）[36]和雙帶隱帶麗魚（Apistogramma bitaeniata）[37]等魚類的研究中，也得出相似的AKP 酶活性變化趨勢。水溫達(dá)到38 ℃后，試驗(yàn)魚大量死亡，各品系A(chǔ)KP 酶活性均有下降，這與花（Hemibarbus maculatus）[38]研究結(jié)果相似；此時(shí)XY3 和HF2的AKP 酶活性顯著高于其他品系，因此，這2 個(gè)品系的高溫耐受性相對(duì)較強(qiáng)。

LZM 是衡量水生動(dòng)物免疫狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)[39]。在環(huán)境脅迫條件下，魚類通過升高溶菌酶活性做出免疫防御[40]。大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus L.）[41]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[42]和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[43]等魚類的研究均表明，溫度影響著魚體的LZM 酶活性。本試驗(yàn)降溫組中，隨水溫的下降，5 個(gè)品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均呈先上升后下降的趨勢，其均在水溫為13 ℃時(shí)最高，且差異顯著（P＜0.05），在水溫為5 ℃時(shí)最低。因此推測，低溫對(duì)幼魚機(jī)體的免疫力產(chǎn)生了抑制作用。史氏鱘[44]（Acipenser schrenckii）幼魚急性低溫脅迫試驗(yàn)中也有類似結(jié)論。

升溫組中，隨水溫的升高，YS 的LZM 酶活性先升高后降低，水溫為30 ℃最高，但其隨水溫的升高其下降不顯著（P>0.05），其余4 個(gè)品系則均呈上升趨勢。其余各品系在水溫為38 ℃時(shí)，YS 和LZM酶活性最高，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。這與大菱鲆溫度脅迫下LZM 酶活性變化態(tài)勢相似[45]。此外，水溫為30 ℃時(shí)，YS 的LZM 酶活性達(dá)到最高值，XY3 和HF2的酶活性顯著高于XY1 和XY2。LZM 酶活性的這種變化趨勢也很好地解釋了升溫過程中，YS 最早出現(xiàn)大批量死亡，而XY3 及HF2存活率最高的現(xiàn)象。

酶活性表達(dá)與變化水平反映了5 個(gè)品系黑鯛?wèi)?yīng)對(duì)溫度應(yīng)激時(shí)，體內(nèi)免疫水平及其器官機(jī)能狀態(tài)以及應(yīng)對(duì)水溫變化的能力。HF2在升溫和降溫組中均有良好的抗逆性，這與其在養(yǎng)殖過程中的性狀優(yōu)勢表現(xiàn)相一致[46]。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在水溫為5~34 ℃時(shí)，5 個(gè)品系黑鯛存活率均>84%。T-SOD 等酶活性反映出不同品系黑鯛對(duì)水溫的上升或下降的適應(yīng)水平與抗逆性存在差異，而且同一品系對(duì)高溫或低溫的酶活性變化也有不同。其中，對(duì)水溫變化的耐受能力最高的為XY3 和HF2，其次為XY1 和XY2，YS 最低。XY3 選育新品系及由雜交得到的HF2新品系面對(duì)高溫或低溫的脅迫均有較好表現(xiàn)。