譚 林，陸 陽，王正珅

（1.中央儲備糧遼寧質(zhì)檢中心有限公司，沈陽 110034；2.中央儲備糧通遼東郊直屬庫有限公司，遼寧 通遼 028012）

玉米又名玉蜀黍，禾本科一年生草本植物，原產(chǎn)于美洲安第斯山脈， 哥倫布發(fā)現(xiàn)美洲大陸后玉米傳至歐洲， 于明代傳入我國， 在我國的種植歷史已有400 多年。 由于玉米富含碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)及一些重要的維生素和礦物質(zhì)，物美價廉，深受消費者喜愛。 玉米是僅次于水稻和小麥的中國第三大谷類作物，通常作為早餐谷物食用，如玉米粉粥、和玉米煎餅， 同時玉米在世界范圍內(nèi)也被廣泛用作牲畜飼料，成為人與動物的主要營養(yǎng)谷類作物[1]。

真菌毒素是真菌的次級代謝產(chǎn)物， 是糧食作物的主要污染源之一， 這些次級代謝產(chǎn)物被高等動物攝入時會引起毒性反應(yīng)， 嚴(yán)重威脅人類及動物的健康[2]。 我國玉米種植面積大、產(chǎn)量高，但其在收獲、貯藏期間易受到外界環(huán)境因素的影響產(chǎn)生真菌， 其次級代謝產(chǎn)物真菌毒素主要有三種： 黃曲霉B1（AFB1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）。在保證糧食安全過程中，對糧食收購時進行真菌毒素檢測至關(guān)重要[3]。

目前國內(nèi)外對真菌毒素的檢測技術(shù)研究主要有酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA）、 高效液相色譜法（HPLC）、膠體金免疫層析法（CGIA）、近紅外光譜法（NIR）等[4]，本文綜述了以上幾種真菌毒素檢測方法，并對其準(zhǔn)確度，優(yōu)缺點做了分析，對其在糧食收購過程中的操作復(fù)雜度，時效性進行了評估，以期為真菌毒素檢測技術(shù)的研究及推廣提供理論依據(jù)。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作為定量檢測玉米中真菌毒素最常用的一種方法， 不僅能進行定量檢測還可以進行真菌毒素的定性分析。 由于玉米中真菌毒素種類眾多，為達到理想的分離效果，減少各毒素之間的影響，所以選擇的檢測條件也不同。 黃曲霉毒素B1因其產(chǎn)生熒光強度較弱，多采用柱前、柱后衍生，優(yōu)化其流動相，以此來增強熒光檢測信號，從而進行定量檢測。 常用的提取溶劑主要有甲醇-水、乙腈-水，可選用的色譜柱有硅膠固相萃取柱、 免疫親和柱及多功能凈化柱， 其中C18是最實用的用于檢測真菌毒素的SPE 柱[5]。

在提高檢出限和回收率方面， 很多學(xué)者探尋了凈化柱方面的改良。 黎睿等[6]通過建立免疫親和柱凈化-高效液相色譜法同時測定糧食中黃曲霉毒素B1等8 種真菌毒素， 根據(jù)信噪比為3 的峰響應(yīng)值，確定各真菌毒素的檢出限。 樣品中各真菌毒素的平均加標(biāo)回收率， 玉米為80.0%~104.5%， 小麥為83.2%~102.8%，方法精密度為2.6%~10.2%。 李輝章等[7]自制DON 凈化柱,采用高效液相色譜法，優(yōu)化了提取條件，選取乙腈—水溶劑進行提取，通過自制的DON 凈化柱凈化， 采用C18分離柱和紫外檢測器測定。 結(jié)果表明：樣品通過乙腈—水（體積比為84∶16）混合溶劑和超聲20 min 的提取，可大幅度提高方法回收率； 嘔吐毒素在0.5～8.0 mg/kg 內(nèi)線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)為0.999；在0.5、2.0 和8.0 mg/kg 的加標(biāo)水平下， 回收率為95.1%～102.3%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～6.4%，檢出限（信噪比）為50 μg/kg。 在玉米零食產(chǎn)品的檢測方面， 高效液相色譜也發(fā)揮了巨大的作用。Oveisi 等[8]確定了玉米粉中真菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEN）的存在并使用具有熒光檢測功能的高效液相色譜法分析了38個不同品牌樣品（玉米粉和奶酪零食）中的玉米赤霉烯酮。在玉米粉和奶酪零食樣品中檢測到玉米赤霉烯酮，其平均含量分別為0.377 mg/kg （最大，0.889 mg/kg） 和0.832 mg/kg （最大，1.471 mg/kg）。加標(biāo)玉米粉和奶酪零食樣品的回收率在70%~87%之間。 該方法的檢出限為0.01 μg/mL。確定了方法的線性（y= 5.88x+ 0.25，r2= 0.9999），最佳測定范圍是0.05~30 μg/mL。

目前高效液相色譜法檢測糧食中的真菌毒素以靈敏度、回收率高、準(zhǔn)確性強、可檢測真菌毒素種類多的優(yōu)點在科研單位和學(xué)校應(yīng)用廣泛， 但由于設(shè)備不易攜帶且檢測時間過長，樣品前處理方式復(fù)雜，對檢測人員的素質(zhì)要求高，檢測成本高等原因，無法在中小型糧食企業(yè)中進行推廣應(yīng)用， 同時在糧食收購期間， 由于收儲量過大， 無法進行大規(guī)模的篩選檢測、實時和現(xiàn)場分析檢測，因此在優(yōu)化檢測程序、降低檢測成本等方面有廣闊的發(fā)展空間。

2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）最早起源于20 世紀(jì)70 年代，是主要用于檢測各種生物化學(xué)物質(zhì)的免疫分析方法。 ELISA 分析技術(shù)具有快速、簡單、準(zhǔn)確和靈敏度高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于真菌毒素的檢測[9]。 國內(nèi)外許多生物公司制成了ELISA 快速檢測真菌毒素試劑盒，采用間接競爭ELISA 方法，使樣品中的真菌毒素和抗原競爭毒素抗體， 同時毒素抗體與酶標(biāo)物相結(jié)合，經(jīng)TMB 底物顯色，再進行定量分析即可。

為了提高酶聯(lián)免疫的敏感度，Zhan 等[10]開發(fā)了一種DLS 增強型直接競爭性酶聯(lián)免疫吸附法（DLSdcELISA）， 用于檢測玉米中的黃曲霉毒素B1（AFB1）。 利用羥基自由基誘導(dǎo)的金納米粒子(AuNP)聚集放大AuNP 散射信號，開發(fā)的DLS-dcELISA 對玉米中的黃曲霉毒素B1的檢測具有超高靈敏度、高準(zhǔn)確度和較強的實用性。同時，在快速檢測試劑盒方面酶聯(lián)免疫方法也取得了很大的進展，Chandra 等[11]利用競爭性酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對從勒克瑙市當(dāng)?shù)厥袌鍪占挠《扔衩讟悠分械狞S曲霉毒素發(fā)生情況進行了調(diào)查， 結(jié)果顯示真菌數(shù)量與黃曲霉毒素含量沒有顯著關(guān)系。 金福源[12]制備了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體， 成功地建立了可用于DON 檢測的ELISA 方法， 為DON 檢測試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，優(yōu)化了DON 檢測條件，確立了用于DON 檢測的間接競爭ELISA 方法，該檢測方法具有良好的重復(fù)性，可完全應(yīng)用于DON 的實際檢測中。

雖然酶聯(lián)免疫吸附法已成為常用的真菌毒素快速檢測方法， 但由于目標(biāo)化合物是真菌毒素而不是抗原， 因此具有類似化學(xué)基團的化合物也會與抗體相互作用。這種所謂的基質(zhì)效應(yīng)或基質(zhì)干擾，在檢測中常會出現(xiàn)這種情況， 可能會導(dǎo)致樣品中的真菌毒素濃度過高或過低影響最終檢測結(jié)果， 此外酶聯(lián)免疫吸附法還存在驗證不足等問題[13]。 因此，ELISA 方法的精確性仍有待提高。

3 近紅外光譜檢測法

近紅外光譜檢測法（Near Infrared Spectrumetry Instrument，NIR）起源于20 世紀(jì)50 年代，被廣泛應(yīng)用在谷物、水果、蔬菜、飼料等成分的定量檢測，經(jīng)不斷研究探索發(fā)現(xiàn)近紅外光譜是一種用于檢測物質(zhì)中有機化合物最為實用的光譜方法， 因此在谷物真菌毒素檢測中也經(jīng)常被使用到。 Berardo 等[14]從意大利中北部16個地區(qū)收集了280個受自然環(huán)境污染的玉米樣品。分析所有樣品的真菌感染。獲得的結(jié)果表明，NIR 可以準(zhǔn)確地預(yù)測被真菌感染的果仁的發(fā)生率，特別是被細(xì)小鐮刀菌感染的果仁的發(fā)生率。分別使用玉米粒和玉米粉的校準(zhǔn)模型， 可以獲得對總體真菌感染和細(xì)小鐮刀菌百分率的最佳預(yù)測能力。 玉米籽粒樣品中測得的細(xì)小鐮刀菌感染與NIR 預(yù)測值的散點圖證實了這種預(yù)測性能（r2= 0.80）。NIR 方法可用于監(jiān)測收獲后玉米中的霉菌污染。Wang 等[15]利用近紅外光譜成像系統(tǒng)對健康玉米粒表面的黃曲霉毒素B1（AFB1）污染物進行檢測。 通過制備4 種不同的AFB1溶液， 分別在玉米粒表面進行沉積10、20、100 和500 mg/kg。 同時用同樣的方法在30個健康玉米粒表面滴加20%的甲醇，作為對照樣品。 此外，用150個獨立樣本作為驗證，以此來檢驗方法的可重復(fù)性。 結(jié)果表明， 高光譜成像技術(shù)配合PCAFDA 方法，可用于檢測低至10 mg/kg 濃度的AFB1，并可直接應(yīng)用于玉米表面，驗證準(zhǔn)確率為88%。

近年來由于常規(guī)檢測玉米真菌毒素污染的方法比較耗時，對樣品破壞嚴(yán)重，且需要熟練的人員進行操作，因此不可能進行大規(guī)模的無損檢測、實時和現(xiàn)場分析。 因此， 研究了在400~2 500 nm 光譜范圍內(nèi)的可見-近紅外光譜(Vis-NIR)檢測技術(shù)，以快速和無損的方式測定玉米籽粒上的黃曲霉毒素感染被廣泛的應(yīng)用[16]。 糧食收購期間，由于收購量較大，糧食內(nèi)的真菌毒素分布不均， 對近紅外光譜檢測造成了一些難度， 同時近紅外光譜技術(shù)對真菌毒素含量較低的樣品檢測時準(zhǔn)確度不高，穩(wěn)定性差，這些問題還有待解決，同時也具很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法(Colloidal Gold Immunoassay，CGIA)是一種免疫色譜法，其中纖維素膜用作載體， 抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和膠體金特有的顏色反應(yīng)進行示蹤，顯示出肉眼可見的紅色條帶，膠體金溶液在可見光范圍內(nèi)有單一吸收峰， 因此可以用分光光度計來鑒定膠體金的質(zhì)量， 從而實現(xiàn)對待測物質(zhì)的定性或定量分析[17]。

此外， 膠體金免疫層析技術(shù)可同時測量多種真菌毒素。 孔德昭[18]利用膠體金免疫層析技術(shù)結(jié)合制備的五種真菌（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等）單克隆抗體，優(yōu)化了膠體金試紙條標(biāo)記抗體的用量、檢測線包被濃度，制備了多重真菌毒素膠體金試紙條，同時也做了大量的驗證實驗，結(jié)果表明多重真菌膠體金試紙條實現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確、便捷的現(xiàn)場檢測。 曹德康等[19]應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測谷物中的三種真菌毒素， 優(yōu)化了膠體金溶液的pH、抗原包被量、金標(biāo)抗體量，制備了3 種快速檢測試紙條檢測卡， 以高效液相色譜法檢測作為對照實驗， 結(jié)果表明檢測卡的檢測結(jié)果與高效液相色譜法的檢測結(jié)果基本一致，檢測卡靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，室溫條件下保存時間長達12個月。 Xiulan 等[20]研究了黃曲霉毒素B1(AFB1)特異性抗體-膠體金探針的制備及其在開發(fā)黃曲霉毒素B1快速檢測方法中的應(yīng)用， 同時建立了黃曲霉毒素B1的免疫層析(IC) 分析方法。 該方法可在10 min 內(nèi)完成分析，與ELISA 法相比,檢測時間縮短了6～10 倍。 通過肉眼觀察,黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測下限為2.5 ng/mL 左右,比ELISA 法提高了2 倍。

膠體金免疫層析技術(shù)由于其檢測時間短、 準(zhǔn)確度高、不使用毒素標(biāo)準(zhǔn)品等優(yōu)勢在糧油檢測機構(gòu)、糧食企業(yè)被廣泛應(yīng)用。 美國CHARM 公司利用膠體金免疫層析技術(shù)研發(fā)的一款真菌毒素快檢儀， 適用于多種農(nóng)作物（玉米、小麥、大豆、高粱等），可檢測多種真菌毒素且檢測方法相同、操作簡單、攜帶便捷，適用于糧食收購期間真菌毒素檢測的現(xiàn)場篩查[21]。 此種檢測方法雖適用于真菌毒素現(xiàn)場篩查， 但其檢測成本較高，同時在對潮糧檢測時結(jié)果準(zhǔn)確性不高，容易出現(xiàn)假陽性、假陰性的情況[22]，在廣大農(nóng)戶中很難進行推廣。

5 結(jié)論

真菌毒素對農(nóng)業(yè)和食品產(chǎn)品的污染易導(dǎo)致一系列的食品安全問題，影響人類健康。大多數(shù)真菌毒素具有熱穩(wěn)定性，不易被傳統(tǒng)的食品加工方式破壞，所以提高真菌毒素的檢測水平非常重要。 上述各種真菌毒素檢測方法各有優(yōu)缺點， 隨著檢測技術(shù)不斷地深入研究， 結(jié)合當(dāng)前的各項檢測技術(shù)開發(fā)一種檢測時間短、操作簡單、準(zhǔn)確性高、檢測成本低、可推廣性強的檢測方法將是今后真菌毒素檢測的發(fā)展方向。