劉超，景贊，呂雪梅

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺，又稱為密胺或蛋白精，分子式C3N3H6，含氮量達66.67%[1]，是一種白色晶體，熔點為354 ℃，在水、乙二醇和甘油中基本不溶解，微溶于乙醇[2]。三聚氰胺是一種化工原料，在乳粉中限值為2.5 mg/kg。經(jīng)典的凱氏定氮法原理是檢測乳粉中的含氮量，進而換算出乳粉中的蛋白質(zhì)。這種方法存在漏洞，一些不法商家利用氮與蛋白質(zhì)的這種含量關(guān)系，將三聚氰胺人為摻進乳粉，從而造成乳粉中蛋白質(zhì)含量高的假象。過量攝入三聚氰胺導(dǎo)致腎臟內(nèi)形成不溶性結(jié)晶，導(dǎo)致嬰兒的腎功能衰竭甚至死亡。因此檢測乳粉中三聚氰胺很有必要[3]。

檢測三聚氰胺的方法很多，高效液相色譜（HPLC）法[4-6]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[7-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS/MS）法均適合乳粉中三聚氰胺含量的測定。其中，HPLC法是測定三聚氰胺較為常用的方法，一般與紫外檢測器和二級管陣列檢測器聯(lián)用，但其靈敏度和選擇性均低于質(zhì)譜檢測器[12]。試驗用GB/T 22388—2008中第一法高效液相色譜法、第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法分別測定同一樣品中的三聚氰胺含量[13]，同時測定樣品加標回收率，找出2種方法的不足，并提出2種方法的優(yōu)化措施。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

DGU-20A高效液相色譜儀（島津國際貿(mào)易有限公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；HT190R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；JC-GX-24固相萃取儀（聚創(chuàng)華葉儀器實力有限公司）；KQ3200E超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；HSC-12A氮吹儀（北京佳航博創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

三聚氰胺標準品（99.0%，Lot：G133044，Dr. Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內(nèi)標標準品（Melamine- 13 C3，100 μg/mL，CAS號1173022-88-2）；三聚氰胺質(zhì)控樣（3.82±0.70 mg/kg，TF01580051）；甲醇、乙腈、乙酸銨（均為色譜純）；辛烷磺酸鈉、乙酸銨、乙酸（均為優(yōu)級純）；氨水（25%~28%）、三氯乙酸、檸檬酸，均為分析純；乳粉（雀巢高鈣營養(yǎng)奶粉）。

1.3 樣品處理（高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法）

樣品處理見GB/T 22388—2008第一法高效液相色譜法、第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。

1.4 液相色譜法的測定條件

色譜柱CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為離子對試劑緩沖液（檸檬酸、辛烷磺酸鈉，pH 3）與乙腈（90︰10，V/V）；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長240 nm；進樣體積10 μL。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測條件

1.5.1 液相條件

色譜柱為強陽離子交換與C18混合填料，混合比例（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相為乙酸銨溶液與乙腈（1︰1，V/V），乙酸調(diào)至pH 3；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；霧化氣為氮氣，30 ps；干燥氣為氮氣，30 psi；離子化溫度450 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 高效液相色譜法

準確稱取10 mg三聚氰胺標準品于10 mL容量瓶中，用1︰1的甲醇水（V/V）溶解并定容，配制成1 mg/mL的標準儲備液，在4 ℃下避光保存。用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋配制成系列濃度為0.4，0.8，1.0，5.0和10.0 μg/mL的標準工作液，按1.4的條件進行檢測，以峰面積為縱坐標，三聚氰胺濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見表1。

2.1.2 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜外標法

取空白樣品按1.3的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法處理，所得溶液用作2.1.1中三聚氰胺標準儲備液的稀釋液，配制一系列濃度范圍為60~540 ng/mL標準工作液，按1.5的條件檢測，以峰面積為縱坐標，三聚氰胺濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見表1。

2.1.3 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜內(nèi)標法

分別取適量三聚氰胺中間液，加入適量三聚氰胺內(nèi)標液，用1︰1的甲醇水（V/V）溶液定容至10 mL，配制一系列濃度范圍為60~540 ng/mL標準工作液，內(nèi)標濃度為20 ng/mL。以三聚氰胺與內(nèi)標物峰面積比為縱坐標，三聚氰胺濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見表1。

由表1可知：液相色譜法的三聚氰胺在0.4~10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系為y=69 824x+16 359，r=0.999 9；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法三聚氰胺在60~540 ng/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系為y=51.189x+562.61，r=0.997 3；內(nèi)標法的三聚氰胺在60~540 ng/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系為y=0.049 5x+0.289 5，r=0.999 1。3種方法的線性關(guān)系較好，均可用于三聚氰胺的準確定量分析。

表1 不同定量方法的校準曲線

2.2 液相色譜法測定乳粉中三聚氰胺的含量

現(xiàn)有已知三聚氰胺含量的乳粉質(zhì)控樣，三聚氰胺含量為3.82±0.7 mg/kg，采用GB/T 22388—2008第一法高效液相色譜法檢測，計算回收率，所得結(jié)果見表2。

由表2可知：液相色譜法測定乳粉質(zhì)控樣計算結(jié)果未在指定范圍且回收率為81.4%；加標回收試驗的回收率為83.1%，兩者的回收率均在80%左右，說明完全按國標中液相色譜法檢測三聚氰胺，無論質(zhì)控樣還是隨行加標樣均存在回收率較低的問題?？赡艿脑蚴窃跈z測中存在提取不完全、先過濾后定容等不完善的步驟。

表2 液相色譜法測定三聚氰胺的結(jié)果

2.3 液質(zhì)聯(lián)用法測定乳粉中三聚氰胺的含量

為探究前處理、基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，對上述乳粉質(zhì)控樣及隨行加標樣均按照1.3中液質(zhì)聯(lián)用法的步驟進行前處理，所得溶液分別按1.5的條件測定，標準曲線定量計算，三聚氰胺的檢測結(jié)果見表3。

表3 液質(zhì)聯(lián)用法測定三聚氰胺的結(jié)果

結(jié)果表明，液質(zhì)聯(lián)用法測定乳粉質(zhì)控樣及加標回收試驗的回收率分別為82.7%和81.3%，回收率均在同一水平，說明按國標中液質(zhì)聯(lián)用法測定三聚氰胺，無論質(zhì)控樣還是加標樣均存在回收率較低的問題?？赡艿脑蚴菢悠反嬖诨|(zhì)效應(yīng)，雖然采取基質(zhì)配標的方法消除，但只是降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，未徹底消除。

2.4 液相色譜法的改進

2.4.1 液相色譜柱的選用

GB/T 22388—2008高效液相色譜法中只規(guī)定液相色譜柱為C18色譜柱，但在試驗中，三聚氰胺目標峰附近會出現(xiàn)三聚氰酸的雜質(zhì)峰，嘗試不同廠家生產(chǎn)的相同規(guī)格的液相色譜柱，僅資生堂和沃特世的液相色譜柱能完全分開三聚氰胺和三聚氰酸，建議使用這2個廠家的液相色譜柱。

2.4.2 超聲時間和提取次數(shù)的優(yōu)化

GB/T 22388—2008高效液相色譜法中三聚氰胺的提取次數(shù)和超聲次數(shù)均為1次，且超聲時間僅為10 min。但在試驗中，10 min的超聲時間不足以完全將三聚氰胺提取出來。而且，提取次數(shù)1次勢必殘留部分三聚氰胺在殘渣中，導(dǎo)致回收率偏低。方法優(yōu)化為：準確稱取2 g乳粉于離心管中，用12 mL三氯乙酸溶液（1%）和4 mL乙腈提取三聚氰胺，充分搖勻后超聲提取30 min，取出振搖提取10 min，以10 000 r/min離心10 min；上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中；殘渣中加入6 mL三氯乙酸溶液（1%）和2 mL乙腈，按上述步驟提取1次，其余步驟同國標GB/T 22388—2008高效液相色譜法[14-15]。

2.4.3 過濾和定容的優(yōu)化

GB/T 22388—2008高效液相色譜法中，樣品經(jīng)15 mL三氯乙酸（1%）和5 mL乙腈提振蕩、超聲提取之后，經(jīng)用三氯乙酸（1%）潤濕的濾紙過濾，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容。過濾過程中，三聚氰胺在濾紙上有殘留，導(dǎo)致定容溶液中的三聚氰胺濃度偏低，從而使檢測結(jié)果偏低。方法優(yōu)化為將提取液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中用三氯乙酸（1%）定容，棄去初濾液，從收集的濾液中移取5 mL用作待凈化液。

由表4可知，優(yōu)化后的液相色譜法測定乳粉質(zhì)控樣及加標回收試驗的回收率分別為99.0%和98.3%，回收率均接近100%，說明按改進后的液相色譜法，能完全提取乳粉中的三聚氰胺，且在后續(xù)過程中有效降低損失，能滿足實際檢測工作的需要。

表4 優(yōu)化后液相色譜法測定三聚氰胺的結(jié)果

2.5 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的改進

由于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜存在基質(zhì)效應(yīng)，雖然國標中采取基質(zhì)配標準的方法降低基質(zhì)效應(yīng)，但不能徹底消除基質(zhì)效應(yīng)。所以，采用內(nèi)標法測定乳粉中三聚氰胺[16-17]。稱取1 g乳粉，加入20 ng內(nèi)標物質(zhì)，其余步驟按照1.3種液質(zhì)法進行前處理，所得溶液分別按1.5的條件測定，內(nèi)標法標準曲線定量計算，最終三聚氰胺的檢測結(jié)果見表5。

表5 內(nèi)標法測定三聚氰胺的結(jié)果

結(jié)果表明，內(nèi)標法測定乳粉質(zhì)控樣及加標回收試驗的回收率分別為100.5%和100.7%，回收率均接近100%，能徹底消除樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，回收率較國標方法大幅提高，使檢測結(jié)果更為準確。

3 結(jié)論

通過加標回收試驗探討和改進液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定乳粉中三聚氰胺的含量。通過液相色譜柱的選用、超聲時間和提取次數(shù)的優(yōu)化、過濾和定容的優(yōu)化等步驟，優(yōu)化液相色譜法檢測三聚氰胺的準確度。由于存在較為嚴重的基質(zhì)效應(yīng)，使用內(nèi)標法測量乳粉中的三聚氰胺，大幅提升檢測的準確度。通過回收率試驗，優(yōu)化乳粉中三聚氰胺檢測的2種方法，大幅提高檢測數(shù)據(jù)的準確性。