董運(yùn)海，楊萌，楊子忠，陳智仙，程倩，張海波

1. 酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宜昌 443003）；2. 安琪酵母股份有限公司（宜昌 443003）

蛋白質(zhì)粉末作為常見的食品配料，普遍是經(jīng)噴霧干燥工藝得到的疏松多孔狀粉末，孔隙率較大，駐留較多的空氣[1-3]。在儲(chǔ)存過程中，蛋白原料中的脂肪與氧氣發(fā)生相互作用，逐漸被氧化酸敗，產(chǎn)生“哈喇”特征風(fēng)味，從而導(dǎo)致蛋白原料出現(xiàn)氣味變化，閾值達(dá)到人們可感知程度后，原料即到了貨架期末尾[4-6]。脂肪含量較高的蛋白質(zhì)粉末原料一般保質(zhì)期較短，如豆?jié){粉（脂肪含量＞10%）、全脂乳粉（脂肪含量＞25%）等的保質(zhì)期一般低于15個(gè)月。而除去大部分脂肪后的脫脂乳粉（脂肪含量＜2%），保質(zhì)期可以達(dá)到24個(gè)月。蛋白原料中的脂肪會(huì)明顯影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和保質(zhì)期[7-8]。

以大豆分離蛋白和濃縮乳清蛋白為代表的蛋白粉末是食品工業(yè)重要的商品化蛋白原料。食用酵母粉是釀酒酵母經(jīng)發(fā)酵富集培養(yǎng)后，經(jīng)濃縮、滅活、干燥獲得的菌體，可作用食品配料[9-10]。酵母蛋白是將食用酵母粉進(jìn)一步提取分離，去除部分非蛋白成分后的高蛋白粉末產(chǎn)品[11]。表1總結(jié)4種高蛋白粉末原料的營養(yǎng)素成分典型值。除開具有高含量的蛋白質(zhì)外，四種蛋白原料都有相似含量的水分和灰分，以及不同含量的碳水化合物。食用酵母粉、酵母蛋白和大豆分離蛋白的脂肪含量都小于5 g/100 g，濃縮乳清蛋白的脂肪含量較高一些。

國內(nèi)使用的4種原料都具有相同的保質(zhì)期（24個(gè)月）。但當(dāng)?shù)鞍自吓c礦物質(zhì)原料復(fù)配使用時(shí)，礦物質(zhì)原料可能影響蛋白原料的穩(wěn)定性，這在營養(yǎng)包等產(chǎn)品中也被證實(shí)[4,12]。

為了對比大豆分離蛋白、濃縮乳清蛋白、食用酵母粉、酵母蛋白的穩(wěn)定性差異，試驗(yàn)將4種高蛋白原料分別與鈣、鐵、鋅等常用礦物質(zhì)化合物混合復(fù)配，采用加速穩(wěn)定性試驗(yàn)方法，用感官分析，以及頂空固相微萃?。℉eadspace solid phase microextraction，HSSPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)考察樣品的氣味穩(wěn)定性變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用酵母粉[安琪酵母（柳州）有限公司]；酵母蛋白[安琪酵母（崇左）有限公司]；大豆分離蛋白（杜邦雙匯漯河食品有限公司）；濃縮乳清蛋白（愛爾蘭哥蘭比亞營養(yǎng)有限公司）。4種原料的生產(chǎn)日期都在試驗(yàn)開始前6個(gè)月內(nèi)。碳酸鈣（宜都大恒碳酸鈣開發(fā)有限公司）；焦磷酸鐵、檸檬酸鋅（南通勵(lì)成生物工程有限公司）；復(fù)合鋁膜（PET/AL/PE，鋁層厚度7 nm，湖北宏裕新型包材股份有限公司）。

藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；頂空分析自動(dòng)進(jìn)樣器（德國GERSTEL公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國Supelco公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

礦物質(zhì)預(yù)混料：將碳酸鈣、焦磷酸鐵、檸檬酸鋅按10︰3︰2的比例稱量后復(fù)配混合均勻。

獨(dú)立組：大豆分離蛋白、濃縮乳清蛋白、食用酵母粉、酵母蛋白4種樣品，分別用復(fù)合鋁膜袋包裝，每袋裝入6.0 g，不排氣密封。

復(fù)配組：大豆分離蛋白、濃縮乳清蛋白、食用酵母粉、酵母蛋白4種樣品各取600 g，分別添加礦物質(zhì)預(yù)混料31.5 g，混合均勻后分別用復(fù)合鋁膜袋包裝，每袋裝入6.0 g，不排氣密封。

1.2.2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)方案

留8種樣品各一袋用于第0個(gè)月感官和儀器分析，其余樣品放置于藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，條件設(shè)置為40 ℃，相對濕度75%，加速試驗(yàn)時(shí)間6個(gè)月。試驗(yàn)期間每1個(gè)月各取8種樣品用于感官分析，并在第3和第6個(gè)月取樣用于儀器分析。

1.2.3 感官分析方法

參考GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評價(jià)員一般導(dǎo)則 第1部分：優(yōu)選評價(jià)員》[13]，選拔、培訓(xùn)10名優(yōu)選評價(jià)員進(jìn)行感官評價(jià)。不同溫度保存的樣品在恒溫間放置1 h后，根據(jù)表2感官評分標(biāo)準(zhǔn)，以冷藏的獨(dú)立組樣品作為對照，對樣品的氣味進(jìn)行打分，取平均值。

表2 感官評價(jià)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 固相萃取方法

采用HS-SPME對樣品的揮發(fā)性氣味化合物進(jìn)行提取和富集。稱取1.0 g樣品。將稱取好的樣品立即用帶有硅橡膠墊的瓶蓋密封，放入旋轉(zhuǎn)振蕩器中，50 ℃平衡30 min，用DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭在50 ℃下萃取30 min，進(jìn)樣，250 ℃解析5 min。

1.2.5 氣相色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱為DB-Heavy WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至70 ℃，以2 ℃/min升至100 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，保持3 min；以高純氦氣為載氣，流速1.66 mL/min；進(jìn)樣方式采用不分流模式；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍（m/z）40~500 Da；數(shù)據(jù)采集方式采用全掃描。

1.2.6 定性與定量分析

1.2.6.1 定性分析

化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與NIST數(shù)據(jù)庫相匹配。選取匹配度＞80%的檢索結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的已知化合物確認(rèn)檢測物成分。

1.2.6.2 定量分析

以揮發(fā)性氣味化合物的峰面積100 000作為基準(zhǔn)1，計(jì)算不同樣品的不同揮發(fā)性化學(xué)組分的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價(jià)獨(dú)立組和復(fù)配組的氣味變化

樣品經(jīng)復(fù)合鋁膜袋密封包裝后，加速條件下放置6個(gè)月。其間每月取各組樣品進(jìn)行感官分析，結(jié)果如圖1和圖2。復(fù)配組樣品出現(xiàn)氣味變化出現(xiàn)的時(shí)間都明顯快于獨(dú)立組樣品，氣味變化的程度也明顯高于獨(dú)立組樣品。特別是大豆分離蛋白、濃縮乳清蛋白的復(fù)配組樣品，在加速試驗(yàn)1個(gè)月時(shí)出現(xiàn)香味減少，異味開始散發(fā)的現(xiàn)象；而在加速試驗(yàn)2個(gè)月時(shí)出現(xiàn)可被感知的哈喇味。

圖1 4種蛋白粉末獨(dú)立組樣品的感官評價(jià)結(jié)果

圖2 4種蛋白粉末復(fù)配組樣品的感官評價(jià)結(jié)果

另外，獨(dú)立組樣品大豆分離蛋白、濃縮乳清蛋白在加速放置過程中也在緩慢出現(xiàn)氣味變化，主要體現(xiàn)在加速放置3~4個(gè)月后，大豆的清香和乳制品的奶香風(fēng)味等蛋白本身特有風(fēng)味的消失。食用酵母粉和酵母蛋白獨(dú)立組樣品在加速條件放置并未出現(xiàn)明顯的氣味變化。

食用酵母粉和酵母蛋白分別與礦物質(zhì)復(fù)配后，在加速試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)氣味的顯著變化，顯示出2種原料與礦物質(zhì)復(fù)配時(shí)良好的穩(wěn)定性。

2.2 GC-MS分析樣品的揮發(fā)性成分變化

采用頂空固相微萃取法對獨(dú)立組和復(fù)配組樣品在加速條件放置0，3和6個(gè)月后的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行富集，利用GC-MS對樣品中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測分析。

橫向?qū)Ρ让糠N蛋白粉末復(fù)配組和獨(dú)立組檢測，發(fā)現(xiàn)復(fù)配組樣品檢測得到的化合物種類與獨(dú)立組樣品一致或更豐富；縱向?qū)Ρ让糠N蛋白粉末不同時(shí)間的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨著加速時(shí)間的延長，樣品檢測得到的化合物種類也更豐富。由表3可知，4種蛋白質(zhì)粉末揮發(fā)性物質(zhì)最豐富的樣品，即加速試驗(yàn)6個(gè)月后復(fù)配組樣品中檢測得到各自所有揮發(fā)性成分?？梢?，大豆分離蛋白復(fù)配組樣品檢測出的化合物最多，共23種；酵母蛋白復(fù)配組樣品的化合物最少，只有10種；濃縮乳清蛋白和食用酵母粉分別檢測出22和13種揮發(fā)性化合物。

另外，從表3可見，揮發(fā)性物質(zhì)以醛類和酮類化合物為主。醛類和酮類化合物的風(fēng)味閾值都很低[14]。醛類一般認(rèn)為是哈喇味的重要成分之一，主要來源于不飽和脂肪酸的氧化降解；酮類化合物同樣來自于不飽和脂肪酸的裂解，通常對香氣貢獻(xiàn)較大[15]。另外，2-戊基呋喃閾值較低，對氣味有很大貢獻(xiàn)，在低濃度時(shí)有金屬味、豆腥味[16]。

表3 4種蛋白粉末復(fù)配組樣品加速條件放置6個(gè)月后所有揮發(fā)性成分檢測結(jié)果

根據(jù)周宸丞等[15]的研究結(jié)論，醛類化合物和2-正戊基呋喃是營養(yǎng)包中產(chǎn)生哈喇味的主要因素。營養(yǎng)包與復(fù)配組的組成相似，都有蛋白粉末原料和礦物質(zhì)成分。因此，對揮發(fā)性成分的分析結(jié)果進(jìn)行篩選，保留所有醛類化合物和2-正戊基呋喃，以及乙酸和吲哚，4種蛋白原料在加速試驗(yàn)不同時(shí)期的揮發(fā)性成分分析結(jié)果如表4和表5所示。

由表4可知，濃縮乳清蛋白和大豆分離蛋白原料各自的獨(dú)立組和復(fù)配組的揮發(fā)性化合物組成在加速放置開始前（0個(gè)月）基本相似，原因是礦物質(zhì)本身無明顯風(fēng)味，未對蛋白原料風(fēng)味產(chǎn)生影響。加速試驗(yàn)開始后，復(fù)配組和獨(dú)立組的揮發(fā)性化合物組成發(fā)生明顯偏離。

表4 濃縮乳清蛋白和大豆分離蛋白獨(dú)立組和復(fù)配組樣品在加速條件放置0，3和6個(gè)月后部分揮發(fā)性成分相對峰面積

己醛有明顯腥味，被認(rèn)為是脂肪酸氧化變質(zhì)的標(biāo)志產(chǎn)物，己醛含量也被認(rèn)為與樣品的氧化程度密切相關(guān)[17]。濃縮乳清蛋白樣品的己醛含量在復(fù)配組加速試驗(yàn)中出現(xiàn)顯著上升，第6個(gè)月時(shí)的含量是獨(dú)立組的約10倍。同時(shí)，己醛也是大豆中的關(guān)鍵性風(fēng)味化合物[18-19]。大豆分離蛋白獨(dú)立組樣品在加速試驗(yàn)中出現(xiàn)己醛含量明顯上升，但復(fù)配組更明顯。辛醛也表現(xiàn)出類似特點(diǎn)。另外，庚醛、2-正戊基呋喃、壬醛在大豆分離蛋白樣品加速試驗(yàn)中復(fù)配組的相對峰面積也明顯更大。

此外，在加速試驗(yàn)中，復(fù)配組樣品相較于獨(dú)立組還額外產(chǎn)生部分揮發(fā)性成分。如濃縮乳清蛋白復(fù)配組樣品產(chǎn)生庚醛、2-正戊基呋喃、2-丁基-2-辛烯醛等揮發(fā)性成分；大豆分離蛋白復(fù)配組樣品產(chǎn)生2-丁基-2-辛烯醛、（E,E）-2, 4-壬二烯醛、乙酸等揮發(fā)性成分。

許多醛類化合物在低濃度時(shí)都有愉悅的香味，如低濃度時(shí)的戊醛果香味，已醛有清香味，庚醛有豆奶香味[20]。壬醛被證明是大豆中天然存在的香氣成分[21]，在乳清蛋白中也是典型風(fēng)味成分[22]。但同一風(fēng)味物質(zhì)在不同濃度或不同環(huán)境體系時(shí)表現(xiàn)千差萬別，超過一定的閾值后就可能在感官上表現(xiàn)出完全不同的感官特征[23]。如在高濃度時(shí)己醛表現(xiàn)出腥味，庚醛、辛醛和壬醛都表現(xiàn)出油脂味和魚腥味[14]。

牛乳中以飽和脂肪酸為主，但也有少量的油酸、亞油酸和亞麻酸[24-25]。而大豆油脂中油酸、亞油酸和亞麻酸的含量較高。壬醛由油酸裂解產(chǎn)生，己醛、庚醛、2-正戊基呋喃都是亞油酸的氧化裂解產(chǎn)物，（E,E）-2, 4-壬二烯醛是亞麻酸的裂解產(chǎn)物[15]。揮發(fā)性成分的分析結(jié)果表明，2種蛋白原料與礦物質(zhì)復(fù)配后在加速放置過程中氣味變化的原因，即蛋白原料中殘留的脂肪酸被氧化裂解產(chǎn)生異味。

食用酵母粉和酵母蛋白原料本身的揮發(fā)性化合物不多，而且在加速試驗(yàn)中也沒有新的化合物產(chǎn)生。多數(shù)醛類化合物都未檢出，所以未在表5中顯示。無論是獨(dú)立組，還是復(fù)配組樣品，能檢出的化合物在加速試驗(yàn)中未出現(xiàn)急劇升高的現(xiàn)象，反而是部分化合物有相對峰面積下降的趨勢。

表5 食用酵母粉和酵母蛋白獨(dú)立組和復(fù)配組樣品在加速條件放置0，3和6個(gè)月后部分揮發(fā)性成分相對峰面積

食用酵母粉和酵母蛋白原料樣品的儀器分析結(jié)果，也進(jìn)一步驗(yàn)證感官分析的結(jié)果，即在加速試驗(yàn)中，2種蛋白的獨(dú)立組和復(fù)配組樣品并未出現(xiàn)氣味的顯著變化。

2.3 氣味變化差異分析

碳酸鈣中含有一些游離金屬離子如Cu2+、Mn2+等雜質(zhì)，以及焦硫酸鐵中游離的Fe2+都會(huì)對脂肪的氧化酸敗起催化作用[6]。過渡金屬離子被認(rèn)為能降低油脂氧化反應(yīng)初始階段的活化能，加速氧化中間產(chǎn)物氫過氧化物的分解[26]。以此能解釋大豆分離蛋白和濃縮乳清蛋白在與礦物質(zhì)預(yù)混料復(fù)配后出現(xiàn)的氣味變化加速和加劇的現(xiàn)象。

酵母也含有比較豐富的不飽和脂肪酸[27-28]。然而，食用酵母粉和酵母蛋白并未變現(xiàn)出礦物質(zhì)對其氣味變化顯著影響的現(xiàn)象。從表3結(jié)果可知，相較于大豆分離蛋白和濃縮乳清蛋白，食用酵母粉和酵母蛋白原料樣品的氣味成分明顯少很多。食用酵母粉和酵母蛋白粉末的生產(chǎn)中并未暴露過多能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的成分，所以本身氣味更簡單。另外，經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，食用酵母粉和酵母蛋白的顆粒都保留有酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，將蛋白質(zhì)及其他成分包裹在內(nèi)。由于細(xì)胞壁的保護(hù)，2種原料與礦物質(zhì)化合物復(fù)配后并未發(fā)生殘留脂肪與礦物質(zhì)的緊密接觸，從而阻止脂肪酸與金屬離子的相互作用。這可能是食用酵母粉和酵母蛋白原料氣味變化微弱的原因。

3 結(jié)論

試驗(yàn)將大豆分離蛋白、濃縮乳清蛋白、食用酵母粉和酵母蛋白4種蛋白質(zhì)粉末原料分別與常見的鈣、鐵、鋅3種礦物質(zhì)化合物進(jìn)行混合復(fù)配，用感官分析對比樣品在加速放置試驗(yàn)過程中的氣味變化，并用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。感官分析結(jié)果表明，大豆分離蛋白和濃縮乳清蛋白原料樣品在與礦物質(zhì)復(fù)配后，加速試驗(yàn)過程中出現(xiàn)顯著的氣味變化，與獨(dú)立樣品相比，氣味變化加快且哈敗氣味濃烈。食用酵母粉和酵母蛋白并未出現(xiàn)明顯的氣味變化。儀器分析結(jié)果表明，大豆分離蛋白和濃縮乳清蛋白原料中的不飽和脂肪酸在礦物質(zhì)化合物中金屬離子的催化下，氧化裂解釋放出多種醛類和其他揮發(fā)性化合物，導(dǎo)致氣味變化。食用酵母粉和酵母蛋白由于本身氣味成分簡單，以及細(xì)胞壁對油脂的包裹隔離作用，從而并未被礦物質(zhì)化合物影響，在加速試驗(yàn)中氣味變化不明顯。