孫 祺，張 倩，柳 依，梁 芬，鄧譯婷，程麗莎，湯文浩，張 毅，4

（1.分子標記（武漢）生物育種有限公司，武漢 430070；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430100；3.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，武漢 430070；4.武漢工程大學(xué)光學(xué)信息與模式識別湖北省重點實驗室，武漢 430205）

簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也稱為微衛(wèi)星序列，普遍存在于真核生物基因組和部分原核生物基因組中［1，2］。SSR 通常由1～6 個重復(fù)串聯(lián)的核苷酸組成，長度一般不超過100 bp［3］。作為常見的分子標記技術(shù)，SSR 標記技術(shù)與其他分子標記如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD），區(qū)間-簡單重復(fù)序列（ISSR）相比，具有在基因組中廣泛分布、信息量較大、呈共顯性遺傳、序列短、容易擴增、多態(tài)性高和特異性位點穩(wěn)定等優(yōu)點，廣泛用于遺傳圖譜，品種鑒定，遺傳多樣性和生物進化，QTL 定位和分子標記輔助育種等研究領(lǐng)域［4-6］。

聚丙烯酰胺凝膠是生化試驗常用的支持介質(zhì)，以聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)與核酸分離［7，8］，因其具有電滲作用小、分辨率高、不易擴散、靈敏度高、易于觀察等優(yōu)點［9-11］，是遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等遺傳育種研究的重要手段，特別是在SSR、ISSR、RFLP 等分子標記研究中具有不可替代的作用［12］。用染料和生物大分子結(jié)合形成有色復(fù)合物是聚丙烯酰胺凝膠電泳后檢測的常用方法，染色的方法有很多，如碘染，銀染，CuCl 染色，熒光染色等［13，14］。銀染法是重要的DNA 染色方法，該方法利用銀離子與核苷酸結(jié)合，并在堿性環(huán)境下使用甲醛使銀離子還原而使凝膠中的DNA 得以顯示為原理，具有高靈敏度和高分辨率得到廣泛應(yīng)用［15］。傳統(tǒng)的銀染法操作流程含有固定、漂洗、銀染、漂洗、顯色和終止6 個主要步驟［16］，操作過程復(fù)雜且需提前配制反應(yīng)溶液，使得其存在操作復(fù)雜、耗時費力等缺點，盡管已有一些研究對銀染法進行了改進，但這些改進在操作上仍存在不足［17，18］。銀離子會對人體及環(huán)境產(chǎn)生危害。相比于銀染法，熒光染料法則是在靈敏度準確的基礎(chǔ)上，操作更為簡便，數(shù)據(jù)整合更為方便的DNA 分子標記檢測技術(shù)［19］?；驹硎抢脽晒馊玖夏芘c核苷酸結(jié)合的特點，在特定紫外光激發(fā)下顯示出熒光條帶，使得核酸分子能夠被檢測出來［19］。

水稻是中國最早開展分子遺傳學(xué)和分子育種研究的糧食作物，且SSR 標記早已成熟應(yīng)用于水稻分子標記輔助育種［20］。研究發(fā)現(xiàn)，在水稻基因組中，大約存在5 700～10 000 個SSR。SSR 標記已被廣泛應(yīng)用于水稻遺傳背景鑒定、抗病性及香味性狀輔助育種、品種檢測等研究［21-24］。本研究運用SSR 熒光染料法和銀染法，選用水稻抗稻瘟病標記Pi2 對48個水稻材料進行檢測，并對這2 種方法的檢測效果作出了比較，并總結(jié)了各自的特點，以期建立成熟的SSR 標記熒光染料檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所選材料為水稻F2群體，由歸田園（武漢）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限責任公司提供。2022 年種植于歸田園試驗示范基地。

所選取的SSR 標記為抗稻瘟病SSR 標記Pi2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 SSR 引物信息

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴增 選取生長10 d 的水稻幼嫩芽及下胚軸（300 mg）置于研缽中，提取DNA［25，26］。首先在裝有樣品的研缽中加入800 μL提取緩沖液（2% CTAB）研磨成勻漿；65 ℃水浴45 min 每隔15 min 取出并上下輕微搖動幾次；加入等體積的氯仿和異戊醇混合液（體積比為24∶1），搖勻；10 000 r/min 離心10 min，吸上清液并轉(zhuǎn)移到另一離心管中；加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇（用以沉淀DNA），混勻后于-20 ℃靜置30 min；10 000 r/min離心30 s，棄上清液，75%乙醇清洗2～3 次，室溫下晾干后加入200 μL ddH2O（含2 μL 10 mg/mL 的RNase）溶解DNA。待DNA充分溶解后于-20 ℃保存。

PCR 反應(yīng)采用10 μL 反應(yīng)體系。模板DNA（50 ng/μL）1 μL，2×Taq Master Mix 5 μL，引物（10 μmol）0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，反應(yīng)試劑均為分子標記（武漢）生物育種有限公司自主研發(fā)；PCR 擴增程序為預(yù)變性94 ℃3 min，變性94 ℃30 s，退火56 ℃30 s，延伸72 ℃45 s，變性、退火、延伸3 個步驟重復(fù)35 個循環(huán)，再進行延伸72 ℃5 min，25 ℃保存10 min。反應(yīng)完成后，加入8～10 μL Loading buffer，4 ℃放置備用。

1.2.2 聚丙酰胺凝膠電泳 將提前洗凈晾干的長玻璃和凹玻璃兩側(cè)各用1 個夾子夾住，組成膠槽。燒杯中先加入約100 mL PAGE 膠，再加入360 μL 10%AP 和36 μL TEMED 并迅速混勻，將混合液注入膠槽，灌膠過程盡量避免產(chǎn)生氣泡；再插入點樣梳子，深入約為3 mm；靜置約10～20 min。

在正極槽（底下）中加入600 mL 1×TBE 緩沖液，組裝上配好凝膠的玻璃板，負極槽上加入800 mL 0.5×TBE 緩沖液直至覆蓋了凝膠上方。緩慢拔出梳子，將凝膠上方多余的膠用槍沖洗干凈，并將氣泡清除，每孔加入0.8～1.5 μLDNA 樣品，采用55 W 恒定功率電泳30 min 左右，至第一條Loading buffer 指示帶（二甲苯青帶，約相當于260 bp 雙鏈DNA）跑至膠板的2/3 處（距底部1/3 處）時停止電泳。

1.2.3 SSR 標記顯影 熒光染料染色顯影，電泳結(jié)束后緩慢撬開玻璃板，取出凝膠，經(jīng)過蒸餾水漂洗后，轉(zhuǎn)移至0.01%核酸染料（染料由分子標記（武漢）生物育種有限公司自主研發(fā)）中泡染10～20 min。泡然結(jié)束后用蒸餾水漂洗1 遍，隨后將聚丙酰胺凝膠至于凝膠成像儀（Bio-Rad）中進行拍照。

銀染顯影，將凝膠用蒸餾水漂洗2 遍，放入0.1% 的AgNO3染液中銀染10 min（1 000 mL 蒸餾水中加入1 g AgNO3），期間將銀染槽至于搖床上輕輕搖晃。銀染結(jié)束后用蒸餾水沖洗凝膠（5～10 s），隨后將凝膠浸在顯影液（1.5%NaOH，0.6%甲醛）中，顯影3～5 min，直至DNA 條帶出現(xiàn)。最后取出凝膠，用蒸餾水沖洗2 遍，室溫下自然干燥，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種染色原理分析

銀染法是重要的DNA 染色法，其原理是利用銀離子可與核苷酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，在堿性環(huán)境下，用甲醛能使銀離子還原成銀褐色顆粒，從而使凝膠中的DNA 及RNA 都染成黑褐色得以顯帶。熒光染料染色法則是利用熒光染料能與核苷酸結(jié)合的特點，在特定紫外光激發(fā)下顯示出熒光條帶，使得核酸分子能夠被檢測出來。

2.2 2 種染色方法效果分析

利用水稻SSR 標記Pi2 檢測48 個樣本的基因型，結(jié)果見圖1。2 種染色方法均可以很好呈現(xiàn)標記帶型，但銀染顯影法的靈敏度相對更高。其中熒光染色方法膠圖背景干凈、清晰，標記DNA 帶型明顯，結(jié)果容易判讀（圖1a），而銀染法膠圖背景上有許多模糊條帶，對標記DNA帶型的讀取有一定干擾（圖1b）。

圖1 熒光染色成像（a）和銀染法成像（b）

2.3 2 種檢測方法的效益比較

對銀染法和熒光法的成本及其工作效率進行比較，結(jié)果見表2。由表2 可知，2 種方法的儀器基本相同，銀染法與熒光染料法完成1 個SSR 反應(yīng)的試劑費用分別為1.30、0.93 元。因此，單純從藥品消耗估計經(jīng)費預(yù)算，熒光染料法低于銀染法。由于微衛(wèi)星熒光標記技術(shù)與凝膠成像系統(tǒng)組合，其檢測效率也顯著高于銀染法，同時由于熒光標記染色技術(shù)先進，不會出現(xiàn)銀染不足或銀染過度導(dǎo)致無法分辨基因型的現(xiàn)象，且熒光染料法的雜帶干擾少，便于后期讀帶，對試驗人員的要求低。在本研究規(guī)模和操作系統(tǒng)下，熒光法的工作效率是銀染法的2.2 倍，考慮到工資成本，熒光染料法較銀染法更為經(jīng)濟。從環(huán)保性方面，由于銀染需要用到重金屬及揮發(fā)性甲醛，對試驗人員及環(huán)境影響較大。

表2 熒光染料法和銀染法檢測1 個樣品所需成本比較 （單位：元）

3 討論

SSR 標記現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動植物研究的許多領(lǐng)域，由于其多態(tài)性好、數(shù)量多、易于檢測和低成本，被認為是用于分子遺傳及分子標記輔助選擇等研究最具競爭性的標記。已有超過35 000 個SSR 標記開發(fā)并映射到大豆所有的20 個連鎖群［27］。許多植物物種，如水稻，玉米，大麥等都開發(fā)了相關(guān)的SSR 標記［28-30］。在國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的新標準中，48 對均勻分布在水稻24 條染色體上的SSR 被發(fā)布出來，王志奎等［31］采用水稻這48 對SSR 引物研究這些標記與雜種優(yōu)勢相關(guān)性，研究表明，主要經(jīng)濟性狀與一些特定引物對應(yīng)的特定條帶表現(xiàn)出較強雜種優(yōu)勢，分子指紋帶型可以為雜種優(yōu)勢的預(yù)測提供一定的指導(dǎo)意義。此外，葉凱等［32］利用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的這48 個水稻SSR 和其實驗室開發(fā)的52 個水稻SSR 標記對江蘇水稻品種的真實性進行鑒定，研究表明，利用2 套標記整合后的93 個標記可區(qū)分所有有表型差異的品種，可以將這93 個標記用于江蘇水稻品種的真實性鑒定。這些標記為品種權(quán)的保護和鑒定提供重要的技術(shù)支持。

針對SSR 標記檢測采用的主要方法有瓊脂糖凝膠電泳檢測法、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法和毛細管電泳熒光檢測法等。隨著二代測序的發(fā)展，在植物中采用測序技術(shù)對SSR 標記進行開發(fā)也已取得了顯著的成果［33］。在這些SSR 標記檢測法中，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)由于其檢測靈敏度和分辨率高的特點，特別適合SSR 這樣的小片段檢測，并且因其操作簡單、所耗時間短、檢測快捷有效在SSR 檢測中廣泛應(yīng)用［34］。銀染法和熒光染料法是聚丙烯酰胺凝膠電泳后常用的顯影方法。銀染技術(shù)具有可與同位素相比擬的高靈敏度而廣泛使用［35］。然而銀染法操作繁瑣，對試驗操作者要求較高，并且銀染法所用的試劑對環(huán)境污染較大，對試驗人員健康也會產(chǎn)生影響。此外，銀染法的顯影時間不易掌控，若時間過短，DNA 條帶顯影不清晰，而過度顯影則會導(dǎo)致膠圖背景黑、噪音大，嚴重干擾結(jié)果讀取。盡管銀染法的改進方法有很多，但這些銀染法的具體操作差異較大，使得初次使用者難以作出最佳選擇。而SSR熒光染料檢測技術(shù)操作簡單，試劑安全，染色后背景干凈干擾小，結(jié)果易讀取，可以開發(fā)圖像識別軟件用機器讀帶，使得工作效率大為提高。

銀染法和熒光染色檢測方法對SSR 標記產(chǎn)物都能夠準確檢測，且均具有較高的靈敏度。從染色效果來看，熒光染料檢測方法與銀染法都能檢測出相應(yīng)的條帶，但熒光染料檢測法，綜合成本低、效率高、所用試劑更為安全穩(wěn)定、對環(huán)境友好、操作方便，不會對人類、環(huán)境造成毒害。因此，熒光染料檢測方法作為SSR 篩選的染色方法，在分子標記研究中更具有廣泛的推廣價值。

4 結(jié)論

本研究通過選取抗稻瘟病SSR 標記Pi2，利用48份水稻材料，對熒光染料檢測和銀染顯影技術(shù)2 種方法的優(yōu)缺點進行探討。結(jié)果表明，2 種檢測方法均具有較高靈敏度，檢測出的條帶清晰可見。本研究研發(fā)的熒光染料檢測結(jié)果出現(xiàn)的條帶清晰度更高。從成本和環(huán)境保護角度來看，本研究提出的熒光染料檢測技術(shù)優(yōu)于銀染顯影技術(shù)。