李 峰，劉玉平，黃新芳，孫亞林，彭 靜

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430064）

慈姑（Sagittaria trifolia）為中國(guó)南方水生蔬菜，主要分布在長(zhǎng)江流域及其以南各?。?，2］，每年栽培面積達(dá)2 萬(wàn)hm2左右。各地慈姑栽培品種多為地方品種，育種多采用無(wú)性系單株系統(tǒng)選育方法進(jìn)行，育種方法單一。為拓展慈姑育種新方法，人工雜交育種方法在慈姑育種上的應(yīng)用逐步展開(kāi)，但相關(guān)研究較少［3，4］。

花粉是高等植物雄配子體，在植物有性繁殖中有很重要的作用。花粉活力的高低是決定結(jié)實(shí)率高低的關(guān)鍵因素，因此，研究慈姑花粉生活力對(duì)于提高慈姑雜交育種效率具有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)研究慈姑花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基配方，并測(cè)定離體常溫和低溫條件下花粉的活力變化動(dòng)態(tài)，以期為慈姑雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集

慈姑花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)材料為野生慈姑資源隨州小葉，慈姑花粉貯藏壽命測(cè)定試驗(yàn)材料為隨州小葉、貴陽(yáng)烏慈和石屏家慈。于慈姑盛花期（7 月），采集第2 天即將開(kāi)放的雄花花序，帶回實(shí)驗(yàn)室扦插于清水中備用。

1.2 花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)

慈姑花粉萌發(fā)采用液體培養(yǎng)基，參照胡適宜［5］的配方，經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)初步確定蔗糖和硼酸的濃度范圍，按照表1 配制液體培養(yǎng)基。選擇若干盛開(kāi)雄花樣品，將花粉刷至干燥培養(yǎng)皿內(nèi)混合均勻，取少量花粉散于載玻片上，加1～2 滴上述配制的液體培養(yǎng)基，置于室溫下培養(yǎng)30 min 后，采用Olympus IX70 型顯微鏡觀察3 個(gè)視野，凡是出現(xiàn)花粉管伸出即認(rèn)為萌芽。試驗(yàn)采用二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3 次。

表1 慈姑花粉萌發(fā)液體培養(yǎng)基配方

1.3 花粉壽命測(cè)定

貯藏溫度設(shè)置25 ℃常溫和4 ℃低溫。取回后的雄花花序樣品分為2 份，一份置于室溫，另一份置于4 ℃冰箱保存，每隔3 h 或6 h，選擇若干盛開(kāi)雄花樣品，將花粉刷至干燥培養(yǎng)皿內(nèi)，混合均勻，取少量花粉置于載玻片上，加1～2 滴上述篩選出的液體培養(yǎng)基，置于室溫下30 min，于顯微鏡下觀察3 個(gè)視野，凡是出現(xiàn)花粉管伸出即認(rèn)為萌芽，觀察3 個(gè)制片。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行分析并作圖，采用DPS v7.05 軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan 氏新復(fù)極差法（SSR）進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)

慈姑花粉在液體培養(yǎng)基萌發(fā)試驗(yàn)中，在顯微鏡下可觀察到部分花粉粒萌發(fā)花粉管，呈乳突狀或者更長(zhǎng)者記為有活力（圖1），不同配方液體培養(yǎng)基條件下慈姑花粉萌芽率方差分析見(jiàn)表2。從表2 可以看出，蔗糖因子間差異達(dá)到極顯著水平，而硼酸因子、蔗糖與硼酸交互因子間差異不顯著。經(jīng)進(jìn)一步多重比較（表3），5 號(hào)處理慈姑花粉的萌芽率最高，達(dá)25.14%，與處理10、9、6、4、2、3、7 差異不顯著，與處理8、1、16、15、11、14、12、13 差異顯著，與處理14、12、13 差異極顯著，即蔗糖濃度為5%～15%的大部分處理的萌芽率較高，蔗糖濃度為20%的所有處理萌芽率均較低。所以，認(rèn)為慈姑花粉萌發(fā)的主要影響因子是蔗糖濃度，其適宜的濃度范圍為5%～15%，本試驗(yàn)篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基為5 號(hào)培養(yǎng)基，即10%蔗糖+50 μg/mL 硼酸。

圖1 慈姑花粉萌芽情況

表2 不同培養(yǎng)基配方慈姑花粉萌芽率方差分析

表3 不同培養(yǎng)基配方處理下慈姑花粉萌芽率

2.2 慈姑花粉貯藏壽命

2.2.1 室溫離體貯存條件下慈姑花粉活力變化動(dòng)態(tài) 在室溫離體貯存條件下，慈姑不同品種花粉活力變化動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖2。從圖2 可以看出，慈姑不同品種花粉萌芽率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低，貯藏0～6 h 內(nèi)花粉活力迅速降低，6 h 之后逐漸緩慢降低，至24 h 時(shí)花粉活力降至5%左右。不同慈姑品種在室溫各貯藏時(shí)間點(diǎn)的花粉萌芽率存在較大差異，石屏家慈明顯高于隨州小葉和貴陽(yáng)烏慈，而隨州小葉和貴陽(yáng)烏慈則差異不大。

圖2 不同慈姑品種25 ℃室溫離體貯藏條件下花粉萌芽率變化動(dòng)態(tài)

2.2.2 低溫離體貯存條件下慈姑花粉活力變化動(dòng)態(tài) 在低溫離體貯藏條件下，慈姑不同品種花粉活力變化動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖3。從圖3 可以看出，慈姑不同品種花粉萌芽率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，石屏家慈在0～6 h 萌芽率迅速下降，6 h 后緩慢降低；隨州小葉和貴陽(yáng)烏慈在0～12 h 萌芽率迅速下降，12 h 后緩慢降低。3 個(gè)品種在低溫貯藏30 h 時(shí)，花粉萌芽率均降至5%～10%。不同慈姑品種在低溫各貯藏時(shí)間點(diǎn)的花粉萌芽率亦存在較大差異，變化規(guī)律與室溫條件下基本一致。

圖3 不同慈姑品種4 ℃低溫離體貯藏條件下花粉萌芽率變化動(dòng)態(tài)

3 小結(jié)

花粉活力檢測(cè)方法主要有染色法和離體萌發(fā)法［6］，離體萌發(fā)法由于直觀、準(zhǔn)確而被廣泛應(yīng)用［7-9］。本試驗(yàn)著重探究了慈姑花粉離體培養(yǎng)基中最適蔗糖濃度和硼酸濃度，結(jié)果表明，蔗糖對(duì)慈姑花粉萌芽影響顯著，慈姑花粉萌芽培養(yǎng)基蔗糖濃度宜為5%～15%，硼酸對(duì)慈姑花粉萌芽的影響差異不顯著，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)篩選的慈姑花粉最適培養(yǎng)基配方為10%蔗糖+50 μg/mL 硼酸。

通過(guò)本試驗(yàn)研究，慈姑花粉活力因品種不同而存在一定差異，在各貯藏時(shí)間段基本表現(xiàn)為石屏家慈＞隨州小葉＞貴陽(yáng)烏慈，不同類(lèi)型慈姑品種的花粉活力變化規(guī)律有待今后對(duì)大量慈姑品種開(kāi)展研究。慈姑花粉在不同貯藏時(shí)間和方式條件下，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐步降低，在室溫貯藏條件下慈姑花粉保持活力可達(dá)24 h 左右，低溫條件可延長(zhǎng)貯藏時(shí)間約6 h，但是在室溫和低溫貯藏條件下，慈姑花粉在貯藏6 h 前保持活力比例較高。因此，慈姑雜交人工授粉時(shí)宜在采集到花粉后6 h 內(nèi)進(jìn)行。在慈姑人工雜交育種實(shí)踐中，一般取當(dāng)天開(kāi)放的花粉進(jìn)行授粉，或者旁晚選取即將開(kāi)放的雄花花序插于清水中，于第二天早晨取盛開(kāi)雄花花粉6 h 內(nèi)完成授粉。