杜 明，于旭東，吳繁花

（1.海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海口 570228; 2.海南大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村學(xué)院，?？?570288;3.海南大學(xué) 熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室；?？?570228）

油茶(Camellia oleifera)屬于山茶科( Theaceae)山茶屬(Camellia)植物，常綠灌木或小喬木，樹高2～3 m[1]，自然狀態(tài)下可高達4～6 m，樹皮淡褐色，光滑。海南油茶又名海南山柚，其花為兩性花，花瓣顏色均為白色，山柚花的發(fā)育通常為腋生或者頂生，花瓣通常5～7 枚，花瓣形狀為倒卵形，先端常有凹入；其雄蕊的數(shù)量較多，花絲的基部呈現(xiàn)聯(lián)合；其子房上位，子房一般有3～5 個子房室，花柱分離，柱頭通常為3～5 裂，有時裂至基部；其子房上位，子房一般有3～5 個子房室，花柱分離，柱頭通常為3～5 裂，有時裂至基部；海南山柚的樹葉生長模式為單葉互生，具有葉柄、革質(zhì)，葉片形狀一般呈卵狀的橢圓形或近橢圓形，葉片長度在6～10 cm，葉片寬度2～4 cm，葉片基部的形狀為楔形，先端略尖，葉片邊緣有細(xì)鋸齒，側(cè)脈不明顯；海南山柚的果實為蒴果，常見棕色粗糙果皮和青色果皮2 種，經(jīng)分類學(xué)鑒定為‘青果油茶'（Camellia vietnamensis）和‘糙 果 油 茶'（Camellia furfuracea），果型多為桃形、球形、扁圓形、橄欖形等，果的直徑在2～4 cm 之間，最大可以超過10 cm，單果質(zhì)量可達275 g，果實內(nèi)部含有種子數(shù)1～12粒，種殼顏色通常為茶褐色或黑色，且具有光澤，種皮有纖維狀絨毛。海南栽培油茶的歷史已有500 多年，于旭東博士研究團隊曾在海南省儋州市王五鎮(zhèn)和瓊海市會山鎮(zhèn)等地發(fā)現(xiàn)了500 年以上的古油茶樹居群[2]。海南油茶樹能適應(yīng)貧瘠、干旱、高溫等惡劣的自然環(huán)境，其抗逆性強，又四季常綠，而且可以生產(chǎn)名貴的木本油料—山柚油，因此，海南油茶可以作為土壤改良、園林綠化、木本油料生產(chǎn)的綠化樹種和經(jīng)濟樹種。但由于海南不是我國油茶油的主產(chǎn)區(qū)，人們對海南油茶的研究較少，其中，海南油茶自交不親和性的機理研究尚未見報道。

植物激素在調(diào)節(jié)植物生長過程起到了重要的作用，植物的花芽分化過程中的生長調(diào)節(jié)和成花的信號傳導(dǎo)均離不開激素的調(diào)節(jié)，植物的自交授粉和異交授粉的親和性和結(jié)實率同樣也受到激素的調(diào)節(jié)作用[3-4]。針對于油茶的內(nèi)源激素檢測方面的研究，文獻顯示，目前只對油茶的葉片、果實等進行了內(nèi)源激素的相關(guān)研究[5-6]，對其授粉過程內(nèi)源激素的研究鮮見報道。本研究在前期對油茶自花和雜交授粉受精研究的基礎(chǔ)上，重點針對其存在的后期自交不親和性，通過內(nèi)源激素動態(tài)檢測來探究其自交不親和性的內(nèi)在機理，旨在為海南油茶的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)良種質(zhì)的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況試驗樣地選擇在海南昌江縣和白沙縣交界的農(nóng)場馬嶺山（110.24°E，20.18°N），該地區(qū)屬于典型的熱帶季風(fēng)氣候區(qū)、地形以坡地為主，大部分為20 世紀(jì)80 年代種植，種植規(guī)模約66.7 hm2，種植密度較大，植株長勢健壯，長期缺乏人工修剪。

1.2 試驗材料隨機選取海南‘青果油茶和‘糙果油茶'樹各10 株作為試驗植株，其中，2 種油茶各選5 株進行自花授粉后套袋編號，將5 株海南青果油茶花的花粉隨機對5 株海南糙果油茶待開放花苞的花柱進行種間雜交授粉（以下稱‘雜交授粉'）后套袋編號。分別在授粉后0、6、12、24、48、72 h 采摘雌蕊(每個時間采樣4 份，每份1 g）。

1.3 試驗方法稱取花柱樣品1 g，液氮研磨，用80%的冰甲醇3 mL 洗入離心管中，4 ℃避光靜置12 h，6 000 r·min-1離心10 min，取上清液，氮氣吹干，加入0.5 mL 冰涼的0.01mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液（PBS），置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用酶?lián)免疫法進行內(nèi)源激素的測定。

1.4 儀器和試劑檢測讀數(shù)使用酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD 伯樂公司，550 型全自動酶標(biāo)儀），氮吹儀（鄭州寶晶電子科技有限公司，YGC-12D 型）。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒［廣州奧瑞達生物科技有限公司，吲哚乙酸(IAA)ARD40178，赤霉素(GA3）ARD40179，脫落酸(ABA)ARD13775，玉米素核苷(ZR)ARD13758］。

1.5 數(shù)據(jù)處理利用Excel 2003 進行數(shù)據(jù)處理和分析，采用SPSS16.0 進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南油茶自花授粉和種間雜交授粉后花柱中IAA 含量的變化從圖1 可知，海南油茶在自花授粉后6 h 內(nèi)，花柱中的IAA 含量由6 120 pmol·g-1顯著升高至13 230 pmol·g-1；6～24 h ，花柱中的IAA 含量的變化趨于平緩；種間雜交授粉后24～48 h ，花柱中的IAA 含量從29 041 pmol·g-1急劇下降至20 165 pmol·g-1，48～72 h ，IAA 含量變化趨于平緩；而自花授粉在24～72 h 期間，IAA 含量基本不變。在整個授粉過程中，‘雜交授粉'的IAA 含量均顯著高于自花授粉IAA 的含量，‘雜交授粉'IAA 含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而自花授粉IAA 含量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。

圖1 海南油茶自花授粉和‘雜交授粉'花柱中IAA 含量的變化

2.2海南油茶自花授粉和種間雜交授粉花柱中GA3含量的變化從圖2 可知，海南油茶授粉后，6 h內(nèi)花柱中的 GA3含量急劇下降，6～48 h 花柱中的GA3含量呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢并且趨于平緩，在授粉后48～72 h，‘雜交授粉'的GA3含量由483 pg·g-1顯著下降至419 pg·g-1，但是自花授粉GA3含量由392 pg·g-1顯著急劇升高至502 pg·g-1。在授粉后的48 h 內(nèi)，‘雜交授粉'GA3含量顯著高于自花授粉的GA3含量，但是在48 h 后，出現(xiàn)自花授粉GA3含量顯著高于‘雜交授粉'GA3含量的情況。在整個授粉過程中，自花授粉GA3含量呈現(xiàn)先下降后緩慢上升最后急劇上升的趨勢，‘雜交授粉'GA3含量呈現(xiàn)先下降后升高再下降的趨勢。

圖2 海南油茶自花授粉和‘雜交授粉'花柱中GA3 含量的變化

2.3海南油茶自花授粉和種間雜交授粉花柱中ZR含量的變化如圖3 所示，海南油茶在雜交授粉后12 h 內(nèi)，ZR 的含量由496 ng·g-1上升至710 ng·g-1，12～24 h 由710 ng·g-1下降至690 ng·g-1，到72 h 又上升至763 ng·g-1。自花授粉后6 h內(nèi)，花柱中ZR 的含量由496 ng·g-1急劇升高至713 ng·g-1，6～12 h 又急劇下降至392 ng·g-1，12～24 h 再急劇升高至1 008 ng·g-1，24 h 后又趨于下降的趨勢。授粉后，前6 h 自花授粉ZR 含量高于‘雜交授粉'ZR 含量，在12 h 自花授粉ZR 含量顯著低于‘雜交授粉'ZR 含量，24～72 h 自花授粉ZR 含量均顯著高于‘雜交授粉'ZR 含量。

圖3 海南油茶自花授粉和‘雜交授粉'花柱中ZR 含量的變化

2.4海南油茶自花授粉和種間雜交授粉花柱中ABA含量的變化如圖4 所示，海南油茶‘雜交授粉'后，花柱中的ABA 含量隨著授粉時間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢變化，授粉后12 h 內(nèi)，ABA 含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢；授粉12 h 后 ，花柱中的ABA 含量開始由426 μg·g-1急劇上升至974 μg·g-1，在24 h ，ABA 含量達到最高974 μg·g-1；授粉超過24 h 后，ABA 含量開始急劇下降。海南油茶自花授粉后，ABA 含量隨著授粉時間的增加呈現(xiàn)先降低后增加再降低的趨勢變化，在授粉后6 h 內(nèi)，ABA 含量由380 μg·g-1下降至212 μg·g-1；6～48 h 內(nèi)，ABA 含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢；授粉48 h 后，ABA 含量又開始呈現(xiàn)下降趨勢。在授粉的整個過程中，自花授粉的ABA 含量顯著低于種間雜交授粉的ABA 含量。

圖4 海南油茶自花授粉和‘雜交授粉'花柱中ABA 含量的變化

2.5 海南油茶自花授粉和種間雜交授粉內(nèi)源激素間的平衡關(guān)系植物內(nèi)源激素發(fā)生的效應(yīng)具有相互作用性，多種內(nèi)源激素的相互作用是植物生長發(fā)育的必要條件。從圖5-a 可知，在整個授粉過程中，自花授粉GA3/ABA 的比值均顯著高于‘雜交授粉'；授粉后6 h 內(nèi)，自花授粉比值呈現(xiàn)上升趨勢，而‘雜交授粉'的比值呈現(xiàn)下降趨勢；自花授粉在6～48 h 均呈現(xiàn)下降趨勢，48～72 h 呈現(xiàn)急劇上升趨勢；‘雜交授粉'在12～24 h 呈現(xiàn)急劇下降趨勢，24～72 h 又呈現(xiàn)急劇上升趨勢。

從圖5-d 可知，自花授粉后ZR/ABA 的比值不斷上下波動，授粉后6 h 呈現(xiàn)上升，6～12 h 有所下降，12～24 h 呈現(xiàn)上升趨勢，24～48 h 呈現(xiàn)下降趨勢，48～72 h 呈現(xiàn)上升趨勢?！s交授粉'后12 h呈現(xiàn)上升趨勢，12～24 h 有所下降，24～72 h 持續(xù)呈現(xiàn)上升趨勢。授粉后6 h，自花授粉ZR/ABA 的比值顯著高于‘雜交授粉'的比值，至12 h 自花授粉比值略低于‘雜交授粉'。

從圖5-b 可知，自花授粉后6 h 內(nèi)，IAA/ABA的比值呈現(xiàn)急劇上升的趨勢，6～12 h 呈現(xiàn)下降趨勢，12～24 h 略有上升，24～48 h 又呈現(xiàn)下降趨勢，48～72 h 急劇上升至71.31。雜交授粉后6 h內(nèi)，IAA/ABA 的比值急劇上升，6～48 h 持續(xù)下降，48～72 h 呈現(xiàn)上升趨勢。在整個授粉過程中，6～12 h 自花授粉的IAA/ABA 比值均低于‘雜交授粉'，24～72 h 自花授粉的IAA/ABA 比值均顯著高于‘雜交授粉'的比值。

從圖5-c 可知，自花授粉后12 h 內(nèi)，IAA/ZR的比值呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，12～24 h 呈現(xiàn)急劇下降趨勢，24～72 h 又緩慢上升。‘雜交授粉'后6 h，IAA/ZR 的比值持續(xù)上升，到12 h 有所下降，12～24 h 呈現(xiàn)上升的趨勢，24～72 h 持續(xù)下降。授粉后6 h，自花授粉的比值顯著低于‘雜交授粉'，至12 h 自花授粉略高于‘雜交授粉'，24 h 以后自花授粉均顯著低于‘雜交授粉'。比值，12～72 h 自花授粉比值均顯著高于‘雜交授粉'比值。

圖5 海南油茶自花授粉和‘雜交授粉'內(nèi)源激素比值的動態(tài)變化

從圖5-e 可知，自花授粉后(GA3+ZR+IAA)/ABA 的比值不斷上下波動，授粉后6 h 內(nèi)呈現(xiàn)上升，6～12 h 有所下降，12～24 h 呈現(xiàn)上升趨勢，24～48 h 呈現(xiàn)下降趨勢，48～72 h 呈現(xiàn)上升趨勢。‘雜交授粉'后6 h 內(nèi)(GA3+ZR+IAA)/ABA 急劇上升，6～48 h 持續(xù)下降，48～72 h 呈現(xiàn)上升趨勢。授粉后12 h 自花授粉比值均顯著低于‘雜交授粉'比值，24～72 h 自花授粉比值均顯著高于‘雜交授粉'比值。

3 討 論

油茶具有后期自交不親和性，自花和‘雜交授粉'（種間雜交授粉）后，花粉粒在柱頭上的萌發(fā)無差異，但花粉管長到柱頭中部后，自花授粉花粉管出現(xiàn)膨大、卷曲、折疊、分叉等不親和反應(yīng)，僅有少部分花粉管生長進入子房隨后停止生長，而‘雜交授粉'花粉管生長分布均勻并有大量花粉管進入子房完成受精過程[6]。本研究結(jié)果表明，內(nèi)源激素對植物的可育性以及花粉萌發(fā)、花粉管伸長及受精過程起到重要作用，這與 Sawhney 和Ma 等的研究結(jié)果相似[7-8]。

本研究結(jié)果表明，高水平的IAA、GA3、ABA和ZR 含量有助于花粉管的生長，這一結(jié)果也在板栗、冬棗、西瓜和梨花等作物中均得到了驗證[9-12]。當(dāng)花粉管進入胚囊后，高水平的GA3含量有可能抑制了花粉管的生長和配子體的釋放，這也說明花粉管在胚囊中的生長和配子體的釋放需要較低水平的GA3含量。

不同植物激素間的平衡關(guān)系對植物的生長發(fā)育起到關(guān)鍵性作用，甘藍(lán)不育系花蕾發(fā)育過程中GA/ABA、IAA/ABA 和IAA/ZR 等比例對花藥發(fā)育起決定性作用，當(dāng)比例失調(diào)時甘藍(lán)不育系小孢子敗育[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，海南油茶自交授粉和‘雜交授粉'GA3/ABA、IAA/ABA、IAA/ZR、ZR/ABA、(GA3+ZR+IAA)/ABA 等比值均存在顯著性差異，這一結(jié)果說明內(nèi)源激素的比例失調(diào)是海南油茶的自交不親和性的影響因素。