王鵬旭 阮 鑫 董曉英

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)是一種由細(xì)胞釋放的膜囊泡,它能夠?qū)⑿畔鬟f給其他細(xì)胞甚至是遠(yuǎn)離囊泡的細(xì)胞,影響受體細(xì)胞的功能,以達(dá)到細(xì)胞間通訊的作用[1, 2]。EV的存在極其廣泛,在哺乳動(dòng)物體內(nèi),EV存在于體液(如血液、尿液、卵泡液、子宮液等)中,且?guī)缀蹼S體液遍布全身。EV可以通過(guò)不同的分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等)傳輸信號(hào),并且可以通過(guò)包裝多種分子來(lái)遞送多種信息。此外,EV的內(nèi)容物、大小和膜組成隨著細(xì)胞來(lái)源、狀態(tài)和環(huán)境條件的改變而發(fā)生一系列的動(dòng)態(tài)變化[2]。作為新型的細(xì)胞間交流方式,EV廣泛參與了許多人體病理和生理過(guò)程,這個(gè)特性讓它成為新的疾病標(biāo)志物和有潛力的疾病治療工具[3]。隨著對(duì)EV研究的不斷深入,EV越來(lái)越多地被用于液態(tài)活檢、癌癥的診斷和治療、免疫調(diào)節(jié)、靶向藥物遞送、組織再生和疫苗接種等。同時(shí)越來(lái)越多的研究表明,EV在女性生殖中也有著重要的通訊作用,包括卵泡發(fā)育、受精、胚胎發(fā)育及質(zhì)量、胚胎植入等階段[4]。因此,它也成為了改善輔助生殖技術(shù)過(guò)程及效果的潛在工具。卵泡發(fā)育作為女性生殖的起始階段,對(duì)后續(xù)生殖過(guò)程的正常進(jìn)行至關(guān)重要,而EV又對(duì)卵泡發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)等作用。因此,本文將從EV的角度出發(fā),與顆粒細(xì)胞(granulosa cell, GC)和卵母細(xì)胞間常規(guī)的細(xì)胞通訊方式進(jìn)行對(duì)比,對(duì)它在卵泡發(fā)育過(guò)程中的交互作用進(jìn)行綜述,并闡述未來(lái)EV在幫助改善早發(fā)性卵巢功能不全的卵泡發(fā)育問(wèn)題上有哪些可能的應(yīng)用。

一、卵泡發(fā)育中顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的交互作用

在卵泡的生長(zhǎng)過(guò)程中,涉及到GC、卵母細(xì)胞和體細(xì)胞之間旁分泌方式的交流,以及促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)等內(nèi)分泌方式的交流。其中最為重要的就是GC和卵母細(xì)胞間的交互作用,并且它們?cè)诼雅莅l(fā)育的不同階段,呈現(xiàn)出不同的交互作用。

1.原始卵泡激活階段的信號(hào)交流:自出生時(shí),原始卵泡就存于卵巢中,它由單層扁平GC和卵母細(xì)胞組成,此時(shí)GC和卵母細(xì)胞之間直接接觸。青春期時(shí),原始卵泡會(huì)被激活,這個(gè)過(guò)程主要由卵母細(xì)胞內(nèi)PI3K/PTEN/Akt/FOXO3信號(hào)通路介導(dǎo),而且GC也在此過(guò)程發(fā)揮重要的作用。在顆粒細(xì)胞中存在著mTOR (mammalian target of rapamycin, mTOR)復(fù)合物分為mTORC1和mTORC2兩種不同的復(fù)合體。mTORC1受到TSC1/TSC2(tuberous sclerosis complex,TSC) 復(fù)合物的調(diào)節(jié)。且RPTOR(regulatory associated protein of mTOR, RPTOR)也是調(diào)節(jié)mTORC1復(fù)合物的重要蛋白。當(dāng)對(duì)原始GC中TSC1和RPTOR的進(jìn)行剔除后,GC中的mTOR1的信號(hào)會(huì)受到相應(yīng)的抑制作用,隨后原始卵泡的激活會(huì)更明顯。該實(shí)驗(yàn)也表明,GC中的mTOR信號(hào)能夠增加GC中KIT-受體酪氨酸激酶配體的表達(dá),這會(huì)導(dǎo)致KIT配體與卵母細(xì)胞表面更多的KIT受體結(jié)合,進(jìn)一步激活PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而促進(jìn)原始卵泡的激活[5,6]。同時(shí)還有研究表明,卵母細(xì)胞中RPTOR的缺失對(duì)卵泡發(fā)育并無(wú)影響[5]。這說(shuō)明原始GC發(fā)出的mTOR信號(hào)可以促進(jìn)原始卵泡的激活,且比卵母細(xì)胞發(fā)出的mTOR信號(hào)更為重要。

2.卵泡生長(zhǎng)階段的信號(hào)交流:原始卵泡被激活后卵母細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng),同時(shí)GC也由鱗狀變成立方形并開(kāi)始增殖。同時(shí),卵細(xì)胞分泌糖蛋白等成分形成透明帶保護(hù)卵細(xì)胞,而多層立方GC則通過(guò)形成跨區(qū)域投射的結(jié)構(gòu)穿透透明帶與卵細(xì)胞相連[7]。TZP的尖端含有間隙連接,GC和卵母細(xì)胞之間通過(guò)間隙連接輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和傳遞信號(hào)分子[8,9]。GC通過(guò)間隙連接向卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),這是由于卵母細(xì)胞缺少關(guān)鍵酶而無(wú)法充分利用葡萄糖、氨基酸和膽固醇等物質(zhì),需要GC的協(xié)助才能吸收[10]。同樣,卵母細(xì)胞向GC傳遞信息分子,這些信號(hào)的主要作用是調(diào)節(jié)GC生長(zhǎng)和功能,如生長(zhǎng)分化因子-9(growth differentiation factor-9, GDF-9)和骨形成蛋白-15(bone morphogenetic protein-15, BMP-15),兩者在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,缺乏GDF-9的小鼠的GC最多只能發(fā)育到2層,缺乏BMP-15的雌性小鼠雖然卵泡生長(zhǎng)的相對(duì)正常,但卵母細(xì)胞的排卵和受精過(guò)程會(huì)受損[11]。目前已經(jīng)證明,GDF-9和BMP-15能夠發(fā)揮協(xié)同作用刺激GC增殖與分化、維持GC形態(tài)、促進(jìn)GC產(chǎn)生絲狀偽足、調(diào)節(jié)GC的糖酵解和膽固醇合成等過(guò)程[12,13]。除了這兩種重要信號(hào)分子,卵母細(xì)胞還能衍生旁分泌因子通過(guò)刺激GC制造丙酮酸來(lái)滿(mǎn)足卵母細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求[7]。

3.卵泡成熟階段的信號(hào)交流:在卵母細(xì)胞未受到FSH的信號(hào)時(shí),其成熟會(huì)被抑制,這種抑制作用需要卵母細(xì)胞和GC的相互配合,即需要卵母細(xì)胞與附壁GC的接觸以及間隙連接來(lái)維持其正常的通訊功能[7,14]。青春期前,GC產(chǎn)生的環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)通過(guò)間隙連接進(jìn)入卵母細(xì)胞抑制環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水解,從而抑制卵母細(xì)胞成熟;青春期后,FSH的激增激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK),MAPK作用于GC來(lái)降低間隙連接的通透性,增加GC內(nèi)cAMP的水平并降低卵母細(xì)胞中的cAMP和cGMP,從而誘導(dǎo)減數(shù)分裂的恢復(fù)以及卵丘的擴(kuò)張[15]。因此,卵母細(xì)胞的成熟抑制和減數(shù)分裂的恢復(fù)階段也同樣需要GC和卵母細(xì)胞間的交流。

二、EV在卵泡發(fā)育中的作用

在卵泡發(fā)育過(guò)程中,除了上述的TZP和間隙連接,EV也是非常重要的通訊工具。根據(jù)EV的發(fā)生機(jī)制、大小、含量和功能,它們分為外泌體、微泡和凋亡小體3種類(lèi)型[16]。目前,很多研究已經(jīng)描述了人類(lèi)卵泡液中的EV的分子特征以及EV在卵泡發(fā)育中的交互作用[17,18],概括為以下3個(gè)方面:

1.EV中的微小RNA(miRNA)促進(jìn)卵泡發(fā)育:卵泡生長(zhǎng)階段,EV傳遞著很多大分子物質(zhì)、RNA、蛋白質(zhì)、DNA等,其中關(guān)于miRNA的研究最多,同時(shí)它也是發(fā)揮作用最大的分子。

從原始卵泡的激活階段開(kāi)始,EV中的miRNA就參與其中。卵泡液外泌體中的miRNA214、miRNA212和miRNA132能夠靶向PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten),抑制其對(duì)PI3K通路的負(fù)調(diào)節(jié)作用,從而激活蛋白激酶B(Akt)并開(kāi)啟PI3K信號(hào)通路,參與調(diào)控原始卵泡的激活。此外,miRNA調(diào)節(jié)的PI3K通路還涉及卵泡成熟的各個(gè)階段,如原始卵泡的存活、顆粒細(xì)胞排卵、周期性卵泡募集和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)等[19]。

除了對(duì)原始卵泡的激活過(guò)程的調(diào)節(jié),EV中的miRNA在卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中也具有重要的通訊作用。研究發(fā)現(xiàn),多種miRNA會(huì)靶向并調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟相關(guān)途徑中的關(guān)鍵信號(hào)通路,例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Wnt信號(hào)通路、MAPK、表皮生長(zhǎng)因子受體通路等。TGF-β在卵泡生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育中起著重要作用;Wnt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)胎兒卵巢卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟以及類(lèi)固醇生成和黃體化的信號(hào)通路;MAPK能夠刺激GC增殖和卵丘擴(kuò)張,還可以影響促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟過(guò)程。此外,MAPK還與表皮生長(zhǎng)因子受體通路一起,促進(jìn)了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。例如,外泌體能夠通過(guò)miRNA靶向和調(diào)節(jié)GC的TGF-β家族成員,影響ACVR1(activin A receptor type 1,ACVR1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和DNA結(jié)合因子2(ID2)功能,從而調(diào)節(jié)卵泡的成熟[20]。此外,miRNA-181a也能靶向TGF-β家族成員激活素,抑制其受體的表達(dá),從而阻斷激活素對(duì)GC的增殖作用[21]。

2.卵泡吸收EV后促進(jìn)卵泡發(fā)育:當(dāng)EV和卵泡共同培養(yǎng)時(shí),EV會(huì)被卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物所吸收,并對(duì)后續(xù)卵泡的發(fā)育起著促進(jìn)的作用。在對(duì)小鼠和牛的實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)用其卵泡液中的外泌體和卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物共同培養(yǎng)后,卵丘會(huì)發(fā)生擴(kuò)張且相關(guān)擴(kuò)張基因的表達(dá)也會(huì)增加,而且從小卵泡中分離出的EV比從大卵泡中分離出的EV表現(xiàn)出更多的活性[22]。后續(xù)對(duì)牛的研究中發(fā)現(xiàn),卵泡液中的EV在被周?chē)腉C吸收后能不同程度地刺激GC的增殖,并且GC優(yōu)先從小卵泡中吸收EV。這也說(shuō)明在卵泡發(fā)育早期的小卵泡階段,GC能從小卵泡中吸收更多的EV,從而能更快地增殖[23]。

3.EV保護(hù)卵泡發(fā)育:EV不僅對(duì)卵泡發(fā)育過(guò)程起著非常重要的調(diào)節(jié)作用,而且還能增強(qiáng)卵泡的防御系統(tǒng)。研究表明,在外界環(huán)境壓力下,卵泡液中的外泌體能夠保護(hù)細(xì)胞,免受外界影響。例如,在氧化應(yīng)激期間,GC產(chǎn)生的EV含有更高比例的抗氧化劑和其他與細(xì)胞防御相關(guān)的物質(zhì)[17,24]。有研究發(fā)現(xiàn),卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體在用卵泡液的EV處理后可減少卵丘細(xì)胞的凋亡和熱休克引起的卵母細(xì)胞損傷[17,25]。

因此,在原始卵泡的激活階段,EV通過(guò)包裝信號(hào)分子miRNA來(lái)對(duì)PI3K通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。隨后在卵泡成長(zhǎng)過(guò)程中,EV作為新的通訊方式,不同于間隙連接通道,它是經(jīng)過(guò)包裝的,而且經(jīng)過(guò)體液運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞。雖然與傳統(tǒng)的通訊方式不同,但卵泡發(fā)育的正常進(jìn)行需要兩者的共同合作。因此,EV在幫助治療卵泡發(fā)育問(wèn)題上具有很好的前景。

三、EV在恢復(fù)卵巢功能上的應(yīng)用方向

1.間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)分泌的EV恢復(fù)卵巢功能:MSC是一種多能干細(xì)胞,具有自我更新、再生和修復(fù)缺陷細(xì)胞的能力,而且它們比其他干細(xì)胞更容易從各種組織中提取。因此,它成為了再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[26]。在女性生殖領(lǐng)域,干細(xì)胞已被證明是恢復(fù)卵巢功能的有效治療工具。例如,骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可以從抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成、減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積、抗卵巢組織纖維化、抑制炎性反應(yīng)等方面促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù)[27]。然而,異體MSC移植過(guò)程中可能存在免疫排斥和致瘤的風(fēng)險(xiǎn)。因此,MSC移植的臨床使用受到限制。

越來(lái)越多的研究證明,MSC可以通過(guò)它們的旁分泌作用治療疾病,而且MSC分泌的細(xì)胞外囊泡與MSC具有相同的作用,例如免疫調(diào)節(jié)以及組織修復(fù)和再生。目前許多研究已經(jīng)說(shuō)明MSC分泌的EV在治療許多疾病方面發(fā)揮重要的作用,如腎病、肝病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。在女性生殖領(lǐng)域,也有研究證明MSC的EV能夠治療卵巢早衰。這些EV主要從誘導(dǎo)血管生成,抑制GC凋亡,減少氧化應(yīng)激等方面來(lái)促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù)[28～30]。相比于干細(xì)胞治療方案,EV缺乏自我復(fù)制能力,沒(méi)有異位分化的危險(xiǎn),不會(huì)導(dǎo)致腫瘤的形成;而且它沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)。因此,干細(xì)胞EV可以為臨床治療應(yīng)用提供更安全的替代方案。

盡管有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,MSC-衍生的EV對(duì)治療卵巢早衰有一定的效果,但是目前相關(guān)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)正在進(jìn)行,MSC-EV在治療卵巢早衰方面的安全性有待確定,而EV療法的安全性將是其能否作為臨床治療的關(guān)鍵。如果EV療法是安全的,研究人員也需要克服很多挑戰(zhàn):(1)為了提升EV療法的治療效率,可以從增強(qiáng)EV內(nèi)的活性成分來(lái)入手,目前已有實(shí)驗(yàn)做了嘗試。(2)應(yīng)該更加了解EV的分子機(jī)制,制定標(biāo)準(zhǔn)化的分離和純化方法。(3)應(yīng)該尋找出大規(guī)模生產(chǎn)EV的方法。

2.基于EV的藥物遞送:目前很多研究正在探索把EV作為天然藥物輸送載體,這是因?yàn)镋V與傳統(tǒng)的藥物遞送比較,具有多方面優(yōu)勢(shì):一方面,EV包裹后的藥物更加穩(wěn)定,不易被免疫系統(tǒng)清除;另一方面,藥物能借助EV跨越生物屏障(如血-腦脊液屏障等)和靶向指定細(xì)胞。目前,基于EV的藥物遞送已經(jīng)嘗試了許多種類(lèi)的化療藥物,而且證明了EV封裝后的治療效果更好,例如,姜黃素在封裝后抗炎效果多出3倍,多柔比星和紫杉醇抗腫瘤作用更強(qiáng),且藥物有著更好的生物活性和靶向效率。但是目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化EV分離和純化方法,而且作為載體的EV細(xì)胞來(lái)源并未確定。同時(shí)女性生殖領(lǐng)域方面的藥物載體研究也很少,因此,基于EV的藥物傳輸系統(tǒng)能否在恢復(fù)卵巢功能上應(yīng)用,需要后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

四、展 望

在卵泡發(fā)育過(guò)程中,GC和卵母細(xì)胞間常規(guī)的通訊模式主要是通過(guò)間隙連接,即通過(guò)間隙連接傳輸信號(hào)分子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。不同于間隙連接,EV僅傳遞信號(hào)分子而不傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),它運(yùn)用包裝的方式,通過(guò)體液到達(dá)受體細(xì)胞傳輸信息,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,特別是通過(guò)其內(nèi)容物miRNA,EV可以對(duì)卵泡發(fā)育過(guò)程中的很多信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此,EV在解決卵泡發(fā)育問(wèn)題方面有很好的前景。

目前EV已有了一些應(yīng)用的方向,例如,液態(tài)活檢和藥物傳輸系統(tǒng),在女性生殖領(lǐng)域,MSC-EV療法有望作為新型無(wú)細(xì)胞療法,是解決卵巢早衰的卵泡發(fā)育問(wèn)題的未來(lái)重要研究方向。除此之外,并未有很多研究去探索EV的治療潛力。鑒于其他領(lǐng)域?qū)V作為藥物遞送系統(tǒng)的研究,也可以使用EV包裝治療卵巢功能的藥物,或者我們可以設(shè)想通過(guò)藥物如中藥的有效成分對(duì)EV的作用過(guò)程進(jìn)行干預(yù),但這兩種方法是否可行需要實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。目前對(duì)EV的各方面應(yīng)用都還處于起步階段,對(duì)EV的作用機(jī)制研究還不完全清楚,而且缺少標(biāo)準(zhǔn)的EV分離純化方法。因此,在今后的研究中,需要對(duì)EV進(jìn)行更細(xì)致地分析,并且在確認(rèn)EV安全性的同時(shí)發(fā)展各種技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行利用,這樣才能將基于EV的治療方式帶向臨床和實(shí)踐。