高媛媛 陳 琦 袁 莉

糖尿病是一種以持續(xù)高血糖為特征的常見慢性病,如果不加以控制會導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥,影響患者生存質(zhì)量甚至導(dǎo)致死亡?，F(xiàn)有療法只能幫助緩解高血糖癥和并發(fā)癥的進展,達到治愈的目的仍遙遙無期。因此,糖尿病的最終治療需要研發(fā)β細(xì)胞替代策略來補償胰島素缺乏。通過胰島移植彌補1型糖尿病患者丟失的β細(xì)胞,在穩(wěn)定血糖方面表現(xiàn)出顯著的益處。但胰島供體的缺乏以及健康胰島難以避免免疫攻擊限制其廣泛應(yīng)用[1]。因此,β細(xì)胞的內(nèi)源性再生成為了備受關(guān)注的話題。α細(xì)胞是β細(xì)胞替代的理想來源:①α細(xì)胞和β細(xì)胞來自共同的內(nèi)分泌祖細(xì)胞,有密切的譜系關(guān)系;②α細(xì)胞增生在糖尿病動物和患者中很常見,構(gòu)成了轉(zhuǎn)分化的潛在豐富來源;③α細(xì)胞分泌胰高血糖素促進血糖升高,若α細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為β細(xì)胞將減少其數(shù)量,有助于降血糖;④在β細(xì)胞極度缺失后,α細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為β細(xì)胞是可行的[2]。為了使α細(xì)胞更多地轉(zhuǎn)分化為β細(xì)胞,必須了解β細(xì)胞發(fā)育和再生的相關(guān)機制,以及有哪些手段可以促進該轉(zhuǎn)分化的發(fā)生。

一、胰腺β細(xì)胞發(fā)育、分化過程

人類胰腺來自內(nèi)胚層的背側(cè)和腹側(cè),在胚胎的不同時期形成背側(cè)和腹側(cè)胰腺芽,這些胰芽由表達胰腺十二指腸同源框蛋白1(Pdx1)的多能祖細(xì)胞組成,隨后,多能祖細(xì)胞分化為尖端和雙能干細(xì)胞。尖端細(xì)胞進一步分化為腺泡細(xì)胞,而雙能干細(xì)胞分化為導(dǎo)管細(xì)胞或內(nèi)分泌細(xì)胞。在內(nèi)胚層背側(cè)和腹側(cè)區(qū)域的Pdx1+細(xì)胞是內(nèi)分泌祖細(xì)胞的起始[3]。神經(jīng)元素3(Ngn3)是始動內(nèi)分泌祖細(xì)胞分化為內(nèi)分泌細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[4]。由于髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1(Myt1)和Ngn3的表達不同,使內(nèi)分泌祖細(xì)胞呈現(xiàn)異質(zhì)性。Myt1+、Ngn3+的內(nèi)分泌祖細(xì)胞向β細(xì)胞發(fā)育,Myt1-、Ngn3+細(xì)胞向α細(xì)胞發(fā)育[5]。肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(MafA)促進β細(xì)胞最終成熟,NK6同源盒1(Nkx6.1)僅存在于β細(xì)胞中,如果缺少Nkx6.1會導(dǎo)致β細(xì)胞發(fā)育異常,而不影響胰腺中其他細(xì)胞的分化與發(fā)育。最后分化成熟的β細(xì)胞表達Pdx1、MafA、Nkx6.1、NK2同源盒2(Nkx2.2)和配對盒基因6(Pax6)等轉(zhuǎn)錄因子。

二、參與α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的轉(zhuǎn)錄因子

參與胰島β細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子主要包括Pdx1、MafA、Pax4、Arx、Nkx6.1、肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,這些基因協(xié)調(diào)表達決定了胰島β細(xì)胞的分化[6]。因此,增強β細(xì)胞標(biāo)志基因表達和(或)抑制α細(xì)胞標(biāo)志基因表達的因子可用于設(shè)計從體內(nèi)α細(xì)胞再生β細(xì)胞或體外發(fā)育β樣細(xì)胞的方案。

1．Pdx1:Pdx1是一種含有同源框的轉(zhuǎn)錄因子,在早期胰腺上皮形成、β細(xì)胞發(fā)育過程和成熟胰島β細(xì)胞中必不可少。缺乏該因子的人類或小鼠無法產(chǎn)生導(dǎo)管、外分泌或內(nèi)分泌細(xì)胞類型而導(dǎo)致胰腺發(fā)育不全。成熟β細(xì)胞中,Pdx1的消耗和減少會導(dǎo)致葡萄糖耐受不良,這表明Pdx1在維持β細(xì)胞功能中的關(guān)鍵作用[7]。Pdx1在胚胎內(nèi)分泌祖細(xì)胞中的高表達導(dǎo)致圍生期α細(xì)胞通過以胰島素/胰高血糖素共表達為特征的中間階段轉(zhuǎn)化為β樣細(xì)胞,并且細(xì)胞表型也發(fā)生變化,導(dǎo)致胰高血糖素陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素陽性細(xì)胞。敲除成熟β細(xì)胞中Pdx1,并用譜系示蹤劑追蹤,發(fā)現(xiàn)Pdx1缺失導(dǎo)致β細(xì)胞身份喪失,獲得了β細(xì)胞到α細(xì)胞重編程的超微結(jié)構(gòu)、α細(xì)胞生理特征以及與內(nèi)源性α細(xì)胞高度相似的轉(zhuǎn)錄譜[8]。

2.MafA:MafA是基本亮氨酸拉鏈家族轉(zhuǎn)錄因子成員,在胰腺后期發(fā)育中能檢測到,可作為胰腺組織的特殊標(biāo)志物[9]。在小鼠胰腺發(fā)育過程中失去MafA并不會改變胰島素陽性細(xì)胞的比例,然而缺乏MafA的小鼠在出生后會患上糖尿病,這表明MafA調(diào)節(jié)β細(xì)胞成熟并且是成人β細(xì)胞胰島素葡萄糖反應(yīng)性表達所必需。MafA和Pdx1的共表達可促進胰島α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。在一項動物實驗中通過胰管輸注攜帶Pdx1和MafA表達盒的腺相關(guān)病毒可將β細(xì)胞毒素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和自身免疫性非肥胖糖尿病小鼠中α細(xì)胞重新編程為功能性β細(xì)胞,也使血糖水平正?；掷m(xù)4個月。在體外Pdx1和MafA的表達也能將人類α細(xì)胞重編程為β細(xì)胞[10]。

3.Pax4:Pax4在胰腺早期分化及成熟胰島細(xì)胞增殖過程中起重要作用。早期在胚胎胰芽中表達,晚期局限于分化的β細(xì)胞中,胰腺發(fā)育成熟后便不再表達。Pax4在胚胎α細(xì)胞中異位表達后,會導(dǎo)致其發(fā)育為β樣細(xì)胞,這表明了Pax4對誘導(dǎo)分化胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞為β細(xì)胞的重要性。通過腺病毒將Pax4轉(zhuǎn)入αTC1.9細(xì)胞中,可導(dǎo)致胰島素合成增加和胰高血糖素抑制,并上調(diào)β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、MafA、Ngn3和Nkx6.1的表達。此外攜帶Pax4表達盒的腺病毒直接輸注到胰腺中會導(dǎo)致糖尿病小鼠的葡萄糖耐量略有改善[11]。因此,胰島中Pax4高表達不僅增加了β細(xì)胞質(zhì)量,也使葡萄糖耐量得到改善。

4.Nkx6.1:Nkx6.1是一種含有同源框的轉(zhuǎn)錄因子,在胰腺發(fā)育的早期以及成人β細(xì)胞中表達。它通過同時誘導(dǎo)β細(xì)胞基因和抑制非β內(nèi)分泌基因來促進β細(xì)胞數(shù)量的增加。例如Nkx6.1可通過與Arx基因激活劑Isl1的競爭直接抑制Arx。當(dāng)β細(xì)胞中Nkx6.1缺失時,β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為δ細(xì)胞,不會轉(zhuǎn)分化為α或胰多肽生成細(xì)胞。Nkx6.1在Ngn3陽性區(qū)域中表達并不能促進β細(xì)胞分化發(fā)育,而當(dāng)Nkx6.1在Pdx1陽性區(qū)域表達時,β細(xì)胞的分化發(fā)育完全恢復(fù),提示Pdx1和Nkx6.1在β細(xì)胞分化與發(fā)育過程中及維持β細(xì)胞正常功能等方面可能具有重要的協(xié)同作用[12]。

5.Arx:Arx是維持α細(xì)胞表型所需的轉(zhuǎn)錄因子,其在α細(xì)胞中選擇性抑制后,可以促進α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β樣細(xì)胞。Chakravarthy等[13]滅活A(yù)rx和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(Dnmt 1),3個月內(nèi)導(dǎo)致α細(xì)胞向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。新形成的β細(xì)胞在用RNA序列分析和譜系追蹤其基因表達時類似于天然β細(xì)胞,新β細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素分泌試驗也呈陽性。生理學(xué)研究表明,轉(zhuǎn)化的α細(xì)胞獲得標(biāo)志性的β細(xì)胞電生理學(xué),并顯示葡萄糖刺激的胰島素分泌,表明Arx是α細(xì)胞介導(dǎo)的β細(xì)胞新生主要觸發(fā)因子。

6．Hnf4α:Hnf4α是調(diào)節(jié)許多負(fù)責(zé)維持成人β細(xì)胞基因表達所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,據(jù)報道,它可以抑制胰高血糖素表達,誘導(dǎo)胰島素表達和分泌,并上調(diào)其他β細(xì)胞表型標(biāo)志物,如Pax4、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(glucose transporter-2, GLUT2)和葡萄糖激酶(glucokinase, GCK)。αTC1.9細(xì)胞系中Hnf4α的過表達上調(diào)Pax4,并抑制αTC1.9細(xì)胞中胰高血糖素的表達。Hnf4α具有誘導(dǎo)β樣細(xì)胞表型-胰島素表達和胰島素分泌的潛力,這包括β細(xì)胞特異性GLUT2以及未加工的胰島素原C肽成分的表達,還包括以葡萄糖劑量依賴性調(diào)節(jié)方式分泌胰島素的能力[14]。盡管Hnf4α在αTC1.9細(xì)胞中誘導(dǎo)了顯著的表型變化,但一些重要的β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如Pdx1沒有被誘導(dǎo),因此重編程并不完整。

三、促進α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子

1.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA):GABA是一種廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),由谷氨酸脫羧酶作用于谷氨酸合成。研究發(fā)現(xiàn),用GABA處理嚙齒動物可將α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為大量β樣細(xì)胞[15]。Ben-Othman等[16]研究認(rèn)為,用GABA處理αTC1.6細(xì)胞,可以抑制α細(xì)胞中Arx的表達,并使Arx從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì),導(dǎo)致胰高血糖素表達減少,胰島素和Pax4表達增加,說明GABA有利于體內(nèi)α細(xì)胞向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Li等[17]創(chuàng)造了一種誘導(dǎo)型Arx過表達的小鼠Min6細(xì)胞系,并尋找能抑制Arx功能的藥物,發(fā)現(xiàn)青蒿素家族的抗瘧藥物(特別是蒿甲醚)能增強體內(nèi)GABA信號,體外研究發(fā)現(xiàn)可改善人胰島細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素釋放,改變?nèi)祟愐葝u的基因譜,誘導(dǎo)α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞。

青蒿素已在臨床上用于瘧疾治療,盡管有龐大的患者隊列,但關(guān)于青蒿素對人類胰腺內(nèi)分泌功能影響的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)仍然缺乏。除了在小鼠細(xì)胞系中觀察到青蒿素和GABA的作用,后續(xù)在小鼠(使用譜系追蹤)、大鼠和斑馬魚體內(nèi)也得到證實。但近年來有研究表明,使用青蒿素或GABA對小鼠進行長期治療后,并沒有刺激α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化或胰島素分泌,因此對此途徑提出了質(zhì)疑[19]。

2.胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1):GLP-1是腸道L細(xì)胞因食糜刺激而分泌,已知具有重要的生理作用,它能誘導(dǎo)胰島素基因轉(zhuǎn)錄和胰島素生物合成,增強葡萄糖刺激的胰島素分泌,增強β細(xì)胞增殖,并抑制β細(xì)胞凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn),胰腺α細(xì)胞是GLP-1作用靶點,在體外應(yīng)用GLP-1激動劑(Exendin-4)和體內(nèi)應(yīng)用表達GLP-1的重組腺病毒(rAd-GLP-1)處理可促進α細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化。由GLP-1引起的α細(xì)胞擴增和轉(zhuǎn)分化可能有助于β細(xì)胞補償。用rAd-GLP-1處理小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠胰腺β細(xì)胞比例增加,說明rAd-GLP-1處理的小鼠中α細(xì)胞可能轉(zhuǎn)分化為β細(xì)胞,并且由GLP-1引起的α細(xì)胞增殖不會對葡萄糖的代謝控制產(chǎn)生不利影響。

成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)是一種在肝臟中高表達的循環(huán)蛋白,在胰腺的α細(xì)胞和β細(xì)胞中也能檢測到其表達[21]。FGF21能誘導(dǎo)α細(xì)胞中Pdx1和Ngn3產(chǎn)生,刺激β細(xì)胞形成,而GLP-1通過α細(xì)胞中cAMP的增加,提高FGF21表達水平。用rAd-GLP-1或Exendin-4可以誘導(dǎo)FGF21,并隨后增加β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子[22]。因此,GLP-1能增強Pdx1和Ngn3的表達,促進體外人胰島細(xì)胞和小鼠體內(nèi)α細(xì)胞向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。然而GLP-1作為一類廣泛使用的降糖藥物,其降糖效應(yīng)是否涉及人胰島α細(xì)胞向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,還需進一步臨床研究。

3.胰高血糖素受體單克隆抗體(GCGRmAb):GCGRmAb通過抑制胰高血糖素功能不僅可以改善血糖控制,還可以促進db/db小鼠和HFD+STZ誘導(dǎo)的T2D小鼠的胰島素分泌并增加β細(xì)胞質(zhì)量[23]。GCGRmAb處理促進了α細(xì)胞回歸到祖細(xì)胞狀態(tài),并誘導(dǎo)了祖細(xì)胞衍生的β細(xì)胞新生[24]。Cui等[25]通過使用了可誘導(dǎo)的Ngn3+細(xì)胞譜系追蹤2型糖尿病小鼠,發(fā)現(xiàn)GCGRmAb組胰島素陽性細(xì)胞比對照組多,表明GCGRmAb在2型糖尿病小鼠中誘導(dǎo)胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞重新激活并向β細(xì)胞分化。此外,發(fā)現(xiàn)GCGRmAb增強了胰島素分泌并上調(diào)了培養(yǎng)的原代小鼠胰島中與β細(xì)胞再生相關(guān)的基因的表達(Ngn3、Glut2和Pdx1),表明GCGRmAb對胰島細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化有直接影響。

4.達格列凈:達格列凈是SGLT2抑制劑,除降糖作用外對β細(xì)胞具有直接保護作用。達格列凈上調(diào)嚙齒動物胰島和αTC1.9細(xì)胞中胰腺祖細(xì)胞和β細(xì)胞特異性標(biāo)志物mRNA水平,表明達格列凈可能誘導(dǎo)α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞,并通過使用α細(xì)胞譜系追蹤證實α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞。此外,達格列凈上調(diào)Pcsk1(編碼激素原轉(zhuǎn)化酶1/3,一種將胰高血糖素前體加工成GLP-1的重要酶)的表達,并增加αTC1.9細(xì)胞中GLP-1的含量和分泌[26]。鑒于GLP-1具有增強β細(xì)胞增殖,促進干細(xì)胞向β細(xì)胞分化,并誘導(dǎo)α細(xì)胞到β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力,因此,達格列凈對β細(xì)胞再生的促進作用可能部分通過α細(xì)胞分泌的GLP-1介導(dǎo)。還發(fā)現(xiàn)達格列凈上調(diào)了培養(yǎng)的原代嚙齒動物胰島和αTC1.9細(xì)胞中Hnf4α的表達,如前所述Hnf4α促進α細(xì)胞向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[14]。因此,Hnf4α可能參與了達格列凈誘導(dǎo)的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。

5.白藜蘆醇:白藜蘆醇已成為一種很有前途的降糖藥,有研究報道其能誘導(dǎo)胰腺α細(xì)胞中幾種β細(xì)胞基因表達和胰島素生成。白藜蘆醇增加關(guān)鍵β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達,例如Pdx1、Ngn3、NeuroD1、Nkx6.1以及FOXO1。用白藜蘆醇處理細(xì)胞24h后,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中以SirT1依賴性機制顯著增加小鼠胰島素mRNA的表達,而胰高血糖素mRNA沒有顯著改變。將HDAC抑制劑與白藜蘆醇結(jié)合使用可進一步增強mRNA和蛋白質(zhì)水平的胰島素誘導(dǎo)[27]。

6.BRD7389:小分子BRD7389對α細(xì)胞具有特異性,可在終末分化的α細(xì)胞中以劑量依賴性上調(diào)胰島素和Pdx1的表達。BRD7389還增加人原代胰島細(xì)胞中β細(xì)胞特異性基因的表達,可能涉及的機制是BRD7389抑制p90核糖體S6蛋白激酶(Rsk)激酶活性,導(dǎo)致胰島素表達增加[28]。Rsk是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,可作為Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的下游效應(yīng)器調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。BRD7389在體外和細(xì)胞培養(yǎng)中具有作為Rsk家族激酶抑制劑的活性,通過同時抑制多個Rsk家族成員發(fā)揮作用,促進胰島α細(xì)胞向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。

綜上所述,α細(xì)胞在β細(xì)胞數(shù)量急劇減少的條件下可轉(zhuǎn)分化為β細(xì)胞的研究,提示α細(xì)胞可作為新的β細(xì)胞產(chǎn)生來源。成熟β細(xì)胞表達Pdx1、Ngn3、Pax4、MafA、Nkx6.1等轉(zhuǎn)錄因子,成功的轉(zhuǎn)分化即通過各種方式使α細(xì)胞表達β細(xì)胞標(biāo)志物和(或)抑制α細(xì)胞標(biāo)志物的表達,并使新形成的β樣細(xì)胞具有一定的生物學(xué)功能。幾種臨床藥物包括GLP-1、達格列凈和GABA,已被證明可促進成年嚙齒動物β細(xì)胞增殖,但在人體中是否具有相同的作用還缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。此外,轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)功能仍需進一步研究,例如細(xì)胞是否在低葡萄糖條件下終止胰島素分泌,或者細(xì)胞是否對各種生理刺激如增加的代謝需求有反應(yīng),因此后續(xù)還需不斷地探索研究?？偠灾?以α細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為β細(xì)胞作為增加功能性β細(xì)胞數(shù)量的靶點,在糖尿病治療中具有巨大潛力。