孟 琦，邱 遷，閻 睿，2，黃文平，2，周文釗，李金金，張幫奎，張 華

（1. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 重慶市渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，重慶 404120；2. 重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404100；3. 重慶匯達(dá)檸檬科技集團(tuán)有限公司，重慶 402600）

紅橘（Citrus reticulata Blanco） 源于蕓香科（Rutaceae） 柑橘屬（Citrus L.） 柑橘種（Citrus reticulata）[1]，英文名（Tangerine）。紅橘皮含有多糖[2]、橘皮苷[3]、檸檬烯[4]等多種活性成分，具備抑菌[5]、抗氧化[6]等生理活性。酵素是以動(dòng)物、植物、菌類等為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分（經(jīng)發(fā)酵制得的對(duì)生命現(xiàn)象有影響的微量或少量物質(zhì)） 的產(chǎn)品[7-8]。紅橘在加工利用中，主要用于陳皮制備的原料[9]，而其他種類開發(fā)產(chǎn)品種類少[10]及附加值低的問題[11]，試驗(yàn)擬利用紅橘皮制備一款紅橘皮酵素，研究其發(fā)酵工藝、生物活性功能成分及其安全性，旨在為紅橘綜合利用開發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

紅橘，購(gòu)自重慶市萬州區(qū)太龍鎮(zhèn)；保加利亞乳桿菌1×1010CFU/g、嗜熱鏈球菌1×1010CFU/g、嗜酸乳桿菌1×1010CFU/g、青春雙歧桿菌1×1010CFU/g，山東中科嘉億生物工程有限公司提供；活性干酵母菌1×1010CFU/g，安琪酵母股份有限公司提供；纖維素酶10 萬U/g，和氏璧生物科技有限公司提供；果膠酶5 萬U/g，南寧龐博生物技術(shù)有限公司提供；七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、亞硝酸鈉、磷酸二氫鉀，成都市科龍化工試劑廠提供；30%過氧化氫（H2O2），重慶市川東化工（集團(tuán)） 有限公司提供；2,2 - 聯(lián)苯基- 1 - 苦基肼基（DPPH），武漢塞維爾生物科技有限公司提供；無水乙醇，重慶市川東化工（集團(tuán)） 有限公司提供；水楊酸，成都新都區(qū)木蘭工業(yè)開發(fā)區(qū)提供；過硫酸鉀，優(yōu)耐德引發(fā)劑（上海） 有限公司提供；氨基酸檢測(cè)試劑盒BC1570、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚，北京索萊寶科技有限公司提供；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司第一分公司提供；氫氧化鈉，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司提供；碳酸鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；硝酸鋁，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、（DNS溶液） 3-5 - 二硝基水楊酸溶液、總SOD 活性檢測(cè)試劑盒（NBT 法），上海橋星貿(mào)易有限公司提供；菌落總數(shù)測(cè)試片，海鹽瑞科儀器廠提供；大腸桿菌技術(shù)測(cè)試片、金黃色葡萄球菌測(cè)試片、沙門氏菌測(cè)試片、黃曲霉素B1 測(cè)試片，廣東達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司提供；鎘（Cd）、鉻（Cr）、鉛（Pb）、砷（As）、汞（Hg） （以上標(biāo)品質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL），國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心提供；濃硝酸、濃鹽酸、氫氟酸（均優(yōu)級(jí)純），成都金山化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)主要儀器設(shè)備

全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋G154DWS；致微儀器公司產(chǎn)品；FA2004 型電子天平，上海津平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；精密天平，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；HGZF-11-101-0 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、S.SW-CJ-1FD 型凈化工作臺(tái)、ZXGP- A2270型十段編程隔水培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；HSY-24 型恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；TG16-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；SUS 304 型皇冠高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品；PHS25 型數(shù)顯酸度計(jì)（精度為0.01 pH 值），上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；酒精計(jì)，衡水正旭電子科技有限公司產(chǎn)品；QYRO-500L 型500 L/h 純水設(shè)備，重慶前沿水處理設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UV-1100D 型紫外可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；BIO-RAD iMark 伯樂酶標(biāo)儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海） 有限公司產(chǎn)品；EXPEC 7000 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，聚光科技（杭州） 股份有限公司產(chǎn)品；AFS-9750 型原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公產(chǎn)品；MARS6 高壓微波消解儀，美國(guó)CEM 公司產(chǎn)品；SQP Sartorius 萬分之一電子天平，德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品。

1.3 工藝流程及操作過程

具體操作為橘皮烘干后打粉、過篩，并按比例加入纖維素酶、果膠酶及無菌水，充分混合，并在500 W 下進(jìn)行超聲酶解，之后在75 ℃，15 min 條件下進(jìn)行巴氏滅菌。滅菌后發(fā)酵液依據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行發(fā)酵。期間以羥基自由基清除率為檢測(cè)指標(biāo)。發(fā)酵后的酵素液經(jīng)離心過濾，即得到紅橘皮酵素。

1.4 紅橘橘皮干粉的制備

將紅橘清洗、剝皮，將紅橘皮在50 ℃恒溫下鼓風(fēng)干燥3 d，粉碎，保存置干燥器內(nèi)備用。

1.5 紅橘皮酵素加工工藝優(yōu)化

1.5.1 菌種篩選試驗(yàn)

量取100 mL 無菌水并加入0.8 g 橘皮粉，0.2 g果膠酶和0.6 g 纖維素酶，搖勻后進(jìn)行酶解，在50 ℃，500 W 下超聲酶解30 min，之后在75 ℃下巴氏滅菌30 min。冷卻后在無菌環(huán)境下分別加入青春雙歧桿菌、酵母菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌各0.5 g，于40 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵3 d。

1.5.2 橘皮粉添加量試驗(yàn)

量取100 mL 無菌水，分別加入0，0.2，0.5，0.8，1.2，1.5 g 橘皮粉，搖勻后加入0.2 g 果膠酶和0.6 g 纖維素酶在50 ℃，于500 W 下超聲酶解30 min。將酶解液于75 ℃下巴氏滅菌30 min 后冷卻至室溫，采取自然發(fā)酵方式，于40 ℃條件下發(fā)酵3 d。

1.5.3 發(fā)酵周期的確定

量取100 mL 無菌水加入0.8 g 橘皮粉，搖勻后加入0.2 g 果膠酶和0.6 g 纖維素酶進(jìn)行酶解，于50 ℃，500 W 條件下超聲30 min。再將酶解液于75 ℃下巴氏滅菌30 min。冷卻后于40 ℃條件下進(jìn)行自然發(fā)酵1，2，3，6，9，12 d。

1.5.4 超聲酶解時(shí)間的確定

量取100 mL 無菌水，加入50 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥3 d 的橘皮粉0.8 g，搖勻，加入0.2 g 果膠酶和0.6 g纖維素酶進(jìn)行超聲酶解，于500 W 下超聲0，40，80，120，160，200 min。再將樣品于75 ℃下巴氏滅菌30 min，冷卻后于40 ℃條件下自然發(fā)酵3 d。

1.5.5 過篩粒徑的確定

量取100 mL 無菌水，將橘皮粉分別過0，10，20，40，60，80 目篩，之后取過篩后皮粉0.8 g，加入0.2 g 果膠酶和0.6 g 纖維素酶于50 ℃下進(jìn)行酶解，酶解后于500 W 下超聲30 min。將酶解超聲后的樣液于75 ℃下巴氏滅菌30 min 后冷卻至室溫，于40 ℃環(huán)境溫度條件下自然發(fā)酵3 d。

1.5.6 紅橘皮酵素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響紅橘皮酵素抗氧化活性的4 個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.6 羥基自由基清除能力測(cè)定

羥基自由基清除能力的測(cè)定方法采用水楊酸法[12]。

1.7 感官評(píng)價(jià)、酒精度和pH 值測(cè)定

紅橘皮酵素感官的測(cè)定方法參考趙鐳等人[13]的文獻(xiàn)對(duì)其外觀（色澤、透明度、狀態(tài)、表面質(zhì)地）、氣味（香氣、香味）、黏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。酒精度使用酒精測(cè)量計(jì)測(cè)定，pH 值使用酸堿度測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定。

1.8 生物活性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的測(cè)定

總酸含量的測(cè)定方法參考朱娜娜等人[14]的方法；總黃酮含量的測(cè)定方法參考魏永生等人[15]的方法；總酚含量的測(cè)定方法參考寧志雪等人[16]的方法；α - 淀粉酶活力的測(cè)定方法、果膠酶活力的測(cè)定方法、纖維素酶活力的測(cè)定方法參考秦宇蒙等人[17]的方法；總SOD 酶活力的測(cè)定方法采用氮藍(lán)四唑（NBT） 顯色法，按照其試劑盒說明書操作；氨基酸含量的測(cè)定采用可見分光光度法，按照其試劑盒說明書操作。

1.9 微生物、黃曲霉素B1 和重金屬測(cè)定

微生物檢測(cè)采用菌落總數(shù)測(cè)試片、大腸桿菌技術(shù)測(cè)試片、金黃色葡萄球菌測(cè)試片、沙門氏菌測(cè)試片，對(duì)酵素是否受到霉菌污染采用黃曲霉素B1測(cè)試片進(jìn)行測(cè)試，重金屬污染限量測(cè)定方法參考黎海靈等人[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅橘皮酵素制備單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同菌種對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

不同菌種對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響見圖1。

圖1 不同菌種對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

由圖1 可知，不同菌種比較試驗(yàn)后，紅橘皮酵素的羥基自由基清除率為（74.16%±0.21%） ～（76.73%±0.15%），存在顯著性差異（p＜0.05），但是差異不明顯。并且其與空白組比較無明顯提升作用，故自然發(fā)酵為最適發(fā)酵方式。試驗(yàn)中羥基自由基清除率與張海燕等人[19]的蘋果自然發(fā)酵酵素相似，表明原材料紅橘皮同樣適合利用自然發(fā)酵方式生產(chǎn)酵素。

2.1.2 不同橘皮粉質(zhì)量濃度對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

橘皮粉質(zhì)量濃度對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響見圖2。

圖2 橘皮粉添加量對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

由圖2 可知，不同橘皮粉添加量試驗(yàn)后，紅橘皮酵素的羥基自由基清除率為（49.09%±0.46%） ～（69.74%±0.73%），存在顯著性差異（p＜0.05）。質(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL 時(shí)清除效果最佳為69.74%±0.73%，羥基自由基清除率最大值是最小值的1.45 倍，差值約為21.84%?？梢婇俜圪|(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL時(shí)達(dá)到最優(yōu)。

2.1.3 不同發(fā)酵周期對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

由圖3 可知，不同發(fā)酵周期試驗(yàn)后，紅橘皮酵素的羥基自由基清除率為（19.75%±5.10%） ～（71.60%±0.74%），存在顯著性差異（p＜0.05），發(fā)酵周期為2 d 時(shí)達(dá)到最優(yōu)。羥基自由基清除率最大值是最小值的4.94 倍，故最佳發(fā)酵周期為2 d。

2.1.4 不同超聲酶解時(shí)間對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響見圖4。

圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

由圖4 可知，不同超聲酶解時(shí)間試驗(yàn)后，結(jié)果顯示紅橘皮酵素的羥基自由基清除率為（61.43%±0.10%） ～（72.26%±0.59%），存在顯著性差異（p＜0.05）。超聲時(shí)間為120 min 時(shí)達(dá)到最優(yōu)。羥基自由基清除率最大值是最小值的1.19 倍，表明超聲酶解時(shí)間為120 min 時(shí)對(duì)紅橘酵素的抗氧化作用有提高。

2.1.5 不同過篩粒徑對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

不同過篩粒徑對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響見圖5。

圖5 不同過篩粒徑對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性的影響

由圖5 可知，不同過篩粒徑試驗(yàn)后，紅橘皮酵素的羥基自由基清除率為（58.81%±0.51%） ～（65.18%±0.12%），存在顯著性差異（p＜0.05）。過篩粒徑為40 目篩時(shí)達(dá)到最優(yōu)?？梢娮罴堰^篩粒徑為40 目篩。與張?jiān)降热薣20]的燕麥酵素最適過篩粒徑60 目近似，因而原材料的粒徑大小對(duì)紅橘皮酵素抗氧化活性有影響。

2.2 紅橘皮酵素正交試驗(yàn)及驗(yàn)證結(jié)果分析

發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，在添加纖維素酶0.2 g、果膠酶0.6 g，發(fā)酵溫度30 ℃條件下，最佳酶解工藝為A3B2C3D3，即橘皮粉質(zhì)量濃度為0.8 g/100 mL，過篩粒徑為60 目，超聲酶解時(shí)間為160 min，發(fā)酵周期為3 d，各因素對(duì)羥基自由基清除率的影響程度依次為D＞C＞A＞B。

發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)顯著性差異結(jié)果見圖3。

由表3 可知，橘皮粉質(zhì)量濃度、過篩粒徑、超聲酶解時(shí)間、發(fā)酵周期有顯著影響，且差異達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)顯著性差異結(jié)果

為驗(yàn)證正交優(yōu)化試驗(yàn)所得工藝是否最佳，分別進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，紅橘皮酵素的羥基自由基清除率平均值為69.34%，RSD≤0.02%，與正交優(yōu)化最佳試驗(yàn)結(jié)果68.49%±0.34%條件相比數(shù)值接近，說明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.3 感官評(píng)價(jià)、酒精度和pH 值檢測(cè)

感官評(píng)價(jià)顯示紅橘皮酵素總體顏色微黃泛橙，澄清透亮，呈液體狀，液面無雜質(zhì)，有熟制橘果香氣和發(fā)酵香味，不黏稠，質(zhì)地均勻。通過一般理化指標(biāo)測(cè)定，紅橘皮酵素pH 值平均值在3.42±0.01，與付龍威等人[21]的枇杷酵素穩(wěn)定于3.5 左右的pH 值持平；酒精度平均在0.27±0.06 g/100 g，小于食用植物酵素一般理化指標(biāo)中液態(tài)酵素乙醇含量≤0.5 g/100 g 的規(guī)定[22]，均符合國(guó)家輕工業(yè)局的推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 生物活性成分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅橘皮酵素總酸含量平均值9.6±5.6 g/kg最低值為6.4 g/kg，與黃寧馨[23]的植物乳桿菌枸杞發(fā)酵液總酸含量6.74 g/kg 相近，紅橘皮酵素的總酸含量最高值15.2 g/kg 與魏雪琴等人[24]的陳釀玫瑰酵素的17.02 g/kg 相差1.82 g/kg，究其原因是隨時(shí)間延長(zhǎng)陳釀酵素發(fā)酵程度較紅橘皮酵素更加豐富。

總黃酮質(zhì)量濃度為0.309±0.001 μg/mL，總酚質(zhì)量濃度為3.139±0.025 mg/mL，是無花果酵素[25]總酚質(zhì)量濃度最大值0.228 mg/mL 的13.77 倍，考慮原因是紅橘皮酵素關(guān)鍵材料紅橘酚酸類物質(zhì)較多?？偘被豳|(zhì)量濃度平均值為0.346±0.03 mg/mL，相較程勇杰等人[26]的柘樹葉酵素最高氨基酸質(zhì)量濃度1.231 mg/mL 低，可能是紅橘皮酵素所采用材料為果皮，且在制備過程種進(jìn)行過巴氏滅菌。

超氧化物歧化酶（SOD） 酶活力為1 410.96±0.899 U/mL，與綦菲等人[27]的紅豆越橘發(fā)酵底物SOD酶活力1 488 U/mL 結(jié)果近似，說明紅橘皮酵素確存SOD 酶活力。α- 淀粉酶活力130.306±0.000 2 U/mL，果膠酶活力1 176.033±0.087 U/mL，纖維素酶活力為66.407±0.015 8 U/mL，與番茄酵素[28]的淀粉酶活力79.289 U/g，果膠酶活力最大值3.733 U/g，纖維素酶活力38.180 U/g 相比，紅橘皮酵素均展現(xiàn)出較優(yōu)的效果。

2.5 致病微生物檢驗(yàn)和重金屬含量檢測(cè)

通過微生物及毒素檢測(cè)分析可知，優(yōu)化后酵素所含的有效活菌數(shù)為2.1×104CFU/mL；未檢出大腸桿菌大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、黃曲霉素B1。通過重金屬限量分析可知，自然發(fā)酵優(yōu)化后的紅橘皮酵素中鉛含量平均值為0.007 8±0.001 87 mg/kg；總砷含量平均值為0.002 8±0.000 97 mg/kg；鎘含量平均值為0.006 6±0.001 93 mg/kg；未檢出鉻和汞，均符合食品安全指標(biāo)污染物限量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[29]。結(jié)果表明，紅橘皮酵素微生物安全性和重金屬限量安全良好。

3 結(jié)論

以羥基自由基清除率為抗氧化活性指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定紅橘皮酵素的最佳工藝。紅橘皮酵素較優(yōu)配比為橘皮粉質(zhì)量濃度0.2 g/100 mL，過篩粒徑60 目，超聲酶解時(shí)間160 min，發(fā)酵周期3 d。根據(jù)該配方工藝制備紅橘皮酵素，羥基自由基清除率可達(dá)69.34%，總酸含量可達(dá)6.4～15.2 g/kg，總黃酮質(zhì)量濃度平均值為0.309 μg/mL，總酚質(zhì)量濃度平均值可達(dá)3.139 mg/mL，SOD 酶活力平均值可達(dá)1 410.96 U/mL，α- 淀粉酶活力平均值可達(dá)130.306 U/mL，果膠酶活性平均值可達(dá)1 176.033 U/mL，總氨基酸含量平均值為0.346 mg/mL，有效活菌數(shù)為2.1×104CFU/mL。未檢出大腸桿菌大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、黃曲霉素B1，鉛、總砷、鎘、鉻、汞五項(xiàng)重金屬指標(biāo)也均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。