柳卓 ，田雪飛 譚小寧 ，郜文輝 翦慧穎 李可心 周琳 張振 曾普華

1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 412000； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 412006；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 412000

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤發(fā)病率第6位、病死率第4位[1]，其高發(fā)病率和高致死率對我國居民健康造成了極大威脅。肝癌起病隱匿，絕大部分患者確診時已處于中晚期，治療復(fù)雜且手段局限，同時面臨費用高、起效慢、不良反應(yīng)大等問題。因此亟需安全、經(jīng)濟、有效的藥物和治療手段。

目前，肝癌發(fā)病機制尚未完全闡明，隨著能量代謝和氨基酸代謝及參與代謝反應(yīng)的酶逐漸被發(fā)現(xiàn)，其中的關(guān)鍵物質(zhì)可能成為腫瘤治療的新靶點[2]。近年來，肝星狀細胞和肝癌細胞的關(guān)系引起研究者關(guān)注，特別是腫瘤細胞和成纖維細胞之間的交流已擴大至腫瘤代謝層面[3]。

固脾消積飲（原益氣化瘀解毒方）是國醫(yī)大師潘敏求團隊研發(fā)的治療原發(fā)性肝癌經(jīng)驗方，已在臨床應(yīng)用30余年，該方以四君子湯為基礎(chǔ)加減，具有益氣健脾、化瘀散結(jié)、清熱解毒等作用[4]。前期藥理研究表明，該方具有調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定瘤體、抗復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等作用[5-6]。本研究結(jié)合人肝癌細胞HepG2和肝星狀細胞LX-2共培養(yǎng)模型，基于氨基酸代謝和能量代謝觀察固脾消積飲對肝癌細胞代謝的影響，為中醫(yī)藥防治肝癌提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞和動物

HepG2細胞，湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中心實驗所惠贈；LX-2細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量220～240 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。本實驗經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院動物倫理委員會批準（2019-0071），對實驗動物的處理均遵循《實驗動物質(zhì)量管理辦法》實施。

1.2 藥物

固脾消積飲（白參10 g，黃芪30 g，半枝蓮30 g，重樓15 g，醋莪術(shù)15 g，甘草5 g），飲片購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房，用適量冷水浸泡30 min，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煮30 min，煎煮2次，合并煎煮液，過濾后濃縮至含原藥材1.8 g/mL，4 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，美國Gibco，批號分別為A4192101、10100147、25200072；Seahorse XF RPMI培養(yǎng)基，美國Agilent公司，批號00620006；CCK8試劑盒，上海碧云天，批號C0073；丙酮酸、葡萄糖ELISA試劑盒，南京建成，批號A081、F006；丙二醛（MDA）檢測試劑盒，英國Abcam公司，批號GR33333591；糖酵解速率測定試劑盒，美國Agilent公司，批號26817104；三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）ELISA檢測試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號201651、206021；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）α一抗、p-AMPKα（Thr172）一抗，美國CST公司，批號#5831、#50081。SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州安泰公司；EIX808U型酶標儀，美國BioTek公司；1100型高效液相色譜儀，德國安捷倫；Seahorse XFe96型能量代謝分析儀，美國Agilent公司；XDS-600C型倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Mini Protean 3 Cell型電泳儀，美國Bio-Rad公司；GBox XRQ型凝膠成像儀，中國GeneCompany公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

LX-2細胞和HepG2細胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至80%后進行傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 共培養(yǎng)體系建立

Transwell共培養(yǎng)體系由上室和下室組成，上室為聚碳酸酯膜（孔徑0.45 μm）做成的小室，下室為培養(yǎng)板。將HepG2細胞以2.5×105個/mL接種于下室，每孔2 mL；LX-2細胞接種于上室，密度5×104個/mL，每孔1 mL。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

2.3 含藥血清制備

20只大鼠隨機分為空白組10只、中藥組10只，分別予蒸餾水、21.6 g/kg固脾消積飲濃縮液灌胃，體積2 mL/100 g，連續(xù)灌胃5 d。第6日腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，收集血清，56 ℃水浴鍋滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃保存。

2.4 分組和給藥

將單獨培養(yǎng)的HepG2細胞和共培養(yǎng)體系各分為對照組（胎牛血清）、陽性藥組（胎牛血清）、空白血清組（5%、10%、20%）和中藥血清組（5%、10%、20%），分別加入相應(yīng)血清培養(yǎng)，陽性藥組加入20 μg/mL順鉑，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

2.5 CCK8法檢測細胞活力

干預(yù)24 h后，向HepG2細胞中加入CCK8溶液100 μL，培養(yǎng)箱靜置2 h，酶標儀波長450 nm測定各孔光密度（OD值）。

2.6 細胞狀態(tài)觀察

培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，向HepG2細胞中加入DAPI，避光充分染色10 min，PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 ELISA檢測

收集HepG2細胞上清液，按照試劑盒說明書檢測TG、TC、丙酮酸和葡萄糖含量。

2.8 丙二醛含量檢測

使用胰蛋白酶消化HepG2細胞，收集細胞，按照試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)MDA含量。

2.9 糖酵解速率測定

干預(yù)24 h后，向HepG2細胞中加入Seahorse XF RPMI培養(yǎng)基2 mL，將細胞放入無CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，按照糖酵解速率測定試劑盒上機檢測。

2.10 Western blot檢測

取10%固脾消積飲含藥血清分別干預(yù)HepG2細胞和共培養(yǎng)體系，處理24 h后，提取蛋白，檢測蛋白濃度。取100 μg蛋白上樣，電泳，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入AMPK、p-AMPKα一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加二抗，搖床孵育2 h，洗膜后用凝膠成像儀成像，計算蛋白相對表達量。

2.11 氨基酸含量檢測

取10%空白血清和10%固脾消積飲含藥血清分別干預(yù)HepG2細胞和共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)24 h后，精確稱取細胞上清液0.2 g，加入6 mol/L鹽酸5 mL，渦旋振蕩1 min混勻，110 ℃反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，加入NaOH配制成中性溶液，5 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL，加入0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液（pH=9.0）1 mL、DNFB溶液1 mL混勻，避光反應(yīng)60 min。冷卻，加磷酸鹽緩沖液定容至5 mL，渦旋混勻，靜置15 min，取1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待測。

色譜條件：安捷倫C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），流動相為1 mol/L乙酸鈉溶液（pH=5.3）-甲醇水（1∶1），柱溫40 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長360 nm。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 固脾消積飲對HepG2細胞增殖的影響

CCK8法檢測結(jié)果顯示，與同一培養(yǎng)體系對照組比較，10%、20%中藥血清組和陽性藥組HepG2細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。DAPI染色觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和空白血清組細胞數(shù)目無明顯變化，中藥血清各組細胞數(shù)目減少，并呈劑量依賴性，表明細胞增殖受到抑制。單獨培養(yǎng)HepG2細胞較共培養(yǎng)HepG2細胞凋亡更明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1、圖1。

圖1 各組HepG2細胞形態(tài)（DAPI染色，×200）

表1 各組HepG2細胞活力比較（±s，OD值）

表1 各組HepG2細胞活力比較（±s，OD值）

注：與同一培養(yǎng)體系對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

共培養(yǎng)組別n 單獨培養(yǎng)1.15±0.10 1.06±0.07 1.16±0.06 1.08±0.05 1.06±0.09 0.43±0.05**0.38±0.03*0.40±0.06**對照組5%空白血清組10%空白血清組20%空白血清組5%中藥血清組10%中藥血清組20%中藥血清組陽性藥組6 6 6 6 6 6 6 6 1.25±0.08 1.22±0.01 1.24±0.02 1.21±0.01 1.05±0.09 0.42±0.02**0.35±0.02*0.39±0.02**

4.2 固脾消積飲對HepG2細胞三酰甘油、總膽固醇、丙酮酸和葡萄糖含量的影響

與同一培養(yǎng)體系對照組比較，10%、20%中藥血清組和陽性藥組細胞上清液TG、TC、葡萄糖含量顯著減少（P<0.05，P<0.01），丙酮酸含量顯著增加（P<0.05，P<0.01）。單獨培養(yǎng)HepG2細胞各成分含量略低于共培養(yǎng)體系，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2、表3。

表2 各組HepG2細胞上清液TG、TC、丙酮酸含量比較（±s，mmol/L）

表2 各組HepG2細胞上清液TG、TC、丙酮酸含量比較（±s，mmol/L）

注：與同一培養(yǎng)體系對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別對照組5%空白血清組10%空白血清組20%空白血清組5%中藥血清組10%中藥血清組20%中藥血清組陽性藥組n 6 6 6 6 6 6 6 6 TG單獨培養(yǎng)1.42±0.05 1.40±0.08 1.38±0.04 1.39±0.02 1.34±0.02 1.06±0.07*1.02±0.09*1.04±0.04**共培養(yǎng)1.56±0.13 1.54±0.09 1.52±0.01 1.49±0.09 1.36±0.06 1.12±0.09**1.08±0.08**1.09±0.02**TC單獨培養(yǎng)1.75±0.19 1.69±0.15 1.70±0.14 1.76±0.13 1.54±0.12 1.35±0.08**1.21±0.07**1.32±0.13**共培養(yǎng)1.87±0.09 1.85±0.08 1.79±0.11 1.82±0.05 1.64±0.04 1.47±0.07*1.37±0.06**1.45±0.09*丙酮酸單獨培養(yǎng)18.05±0.08 18.01±0.05 17.89±0.03 17.76±0.09 19.28±0.16 29.15±0.25**31.21±0.35*27.27±0.43**共培養(yǎng)17.54±0.12 17.65±0.11 17.63±0.09 17.36±0.07 18.25±0.17 25.59±0.12*26.26±0.24*24.25±0.16*

表3 各組HepG2細胞上清液葡萄糖含量比較（±s，102 μmol/mg）

表3 各組HepG2細胞上清液葡萄糖含量比較（±s，102 μmol/mg）

注：與同一培養(yǎng)體系對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別對照組5%空白血清組10%空白血清組20%空白血清組5%中藥血清組10%中藥血清組20%中藥血清組陽性藥組n6 6 6 6 6 6 6 6單獨培養(yǎng)2.08±0.08 2.05±0.04 2.02±0.01 1.98±0.06 1.97±0.04 1.25±0.07**1.12±0.05**1.19±0.06**共培養(yǎng)2.23±0.05 2.13±0.06 2.21±0.04 2.16±0.02 2.04±0.02 1.28±0.09**1.16±0.03**1.22±0.02**

4.3 固脾消積飲對HepG2細胞丙二醛含量的影響

與同一培養(yǎng)體系對照組比較，10%、20%中藥血清組和陽性藥組HepG2細胞MDA含量顯著增加（P<0.05，P<0.01）。見表4。

表4 各組HepG2細胞MDA含量比較（±s，mmol/L）

表4 各組HepG2細胞MDA含量比較（±s，mmol/L）

注：與同一培養(yǎng)體系對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別對照組5%空白血清組10%空白血清組20%空白血清組5%中藥血清組10%中藥血清組20%中藥血清組陽性藥組n6 6 6 6 6 6 6 6單獨培養(yǎng)0.76±0.06 0.75±0.03 0.77±0.04 0.72±0.01 0.87±0.07 1.12±0.09*1.03±0.02*1.11±0.06*共培養(yǎng)0.79±0.02 0.76±0.04 0.79±0.05 0.74±0.01 0.97±0.09 1.04±0.11**1.21±0.12*1.02±0.08*

4.4 固脾消積飲對HepG2細胞糖酵解速率的影響

與同一培養(yǎng)體系對照組比較，10%、20%中藥血清組和陽性藥組HepG2細胞糖酵解速率顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表5。

表5 各組HepG2細胞糖酵解速率比較（±s，mpH/min）

表5 各組HepG2細胞糖酵解速率比較（±s，mpH/min）

注：與同一培養(yǎng)體系對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別對照組5%空白血清組10%空白血清組20%空白血清組5%中藥血清組10%中藥血清組20%中藥血清組陽性藥組n 6 6 6 6 6 6 6 6單獨培養(yǎng)795.72±17.61 786.25±16.82 766.72±15.95 778.68±19.37 645.63±23.61 476.40±25.69**453.18±15.62**469.27±21.49**共培養(yǎng)805.50±18.92 795.38±17.76 801.31±17.42 802.10±14.87 745.31±14.27 487.76±36.51*464.92±24.91*475.34±26.72*

4.5 固脾消積飲對HepG2細胞腺苷酸活化蛋白激酶α蛋白表達的影響

與同一培養(yǎng)體系對照組比較，10%中藥血清組細胞p-AMPKα/AMPKα比值顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見圖2、表6。

圖2 各組HepG2細胞p-AMPKα、AMPKα蛋白免疫印跡

表6 各組HepG2細胞p-AMPKα/AMPKα比較（±s）

表6 各組HepG2細胞p-AMPKα/AMPKα比較（±s）

注：與同一培養(yǎng)體系對照組比較，*P<0.05

組別單獨培養(yǎng)對照組共培養(yǎng)對照組單獨培養(yǎng)10%中藥血清組共培養(yǎng)10%中藥血清組n 6 6 6 6 p-AMPKα/AMPKα 1.12±0.05 1.09±0.04 1.75±0.03*1.74±0.01*

4.6 固脾消積飲對HepG2細胞氨基酸水平的影響

與同一培養(yǎng)體系對照組比較，10%中藥血清組HepG2細胞上清液17種氨基酸含量均顯著減少（P<0.05，P<0.01）。見表7。

表7 HepG2細胞上清液17種氨基酸含量各組比較（±s，n=3，mg/g）

表7 HepG2細胞上清液17種氨基酸含量各組比較（±s，n=3，mg/g）

注：與同一培養(yǎng)體系對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

序號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17氨基酸天冬氨酸谷氨酸絲氨酸精氨酸甘氨酸脯氨酸丙氨酸蘇氨酸纈氨酸蛋氨酸胱氨酸異亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸組氨酸賴氨酸酪氨酸單獨培養(yǎng)對照組0.75±0.01 1.82±0.07 0.53±0.02 0.42±0.03 0.28±0.00 0.48±0.02 0.95±0.03 0.43±0.02 0.07±0.00 1.16±0.09 0.01±0.00 3.16±0.01 0.80±0.01 0.55±0.01 0.17±0.02 0.55±0.01 0.41±0.01 10%空白血清組0.74±0.02 1.80±0.02 0.54±0.05 0.41±0.02 0.24±0.00 0.42±0.02 0.94±0.02 0.43±0.04 0.07±0.00 1.15±0.05 0.00±0.00 3.02±0.08 0.75±0.01 0.54±0.00 0.16±0.02 0.54±0.01 0.40±0.01 10%中藥血清組0.33±0.03*1.12±0.06*0.36±0.02**0.32±0.03*0.16±0.01**0.32±0.02**0.63±0.01**0.23±0.02*0.03±0.01*0.65±0.00**0.00±0.00 2.10±0.10*0.47±0.00**0.33±0.01*0.07±0.01*0.24±0.00*0.33±0.00*共培養(yǎng)對照組1.05±0.02 2.25±0.09 0.62±0.02 0.84±0.04 0.35±0.01 0.59±0.03 1.16±0.04 0.52±0.03 0.12±0.01 1.88±0.06 0.00±0.00 2.73±0.08 1.02±0.01 0.70±0.00 0.17±0.02 0.73±0.01 0.52±0.01 10%空白血清組1.04±0.01 2.24±0.03 0.69±0.05 0.83±0.05 0.34±0.02 0.56±0.02 1.23±0.04 0.53±0.02 0.11±0.01 1.88±0.04 0.00±0.00 2.87±0.03 1.01±0.02 0.65±0.00 0.15±0.01 0.71±0.00 0.50±0.00 10%中藥血清組0.36±0.02*1.21±0.06*0.36±0.02*0.32±0.04*0.16±0.01**0.32±0.02**0.63±0.01*0.23±0.01*0.03±0.00**0.66±0.01*0.00±0.00 2.11±0.10*0.47±0.00**0.33±0.01*0.07±0.00*0.25±0.00*0.34±0.01*

5 討論

肝癌能通過改變腫瘤細胞營養(yǎng)物質(zhì)攝取和代謝途徑改變新陳代謝，從而滿足腫瘤細胞增殖所需條件[7-8]。AMPK是調(diào)節(jié)糖酵解等能量代謝途徑的關(guān)鍵蛋白激酶[9]，干預(yù)肝癌細胞能量代謝和氨基酸代謝途徑成為目前抑制肝癌細胞增殖的新思路。能量代謝是腫瘤細胞的特征，包括糖酵解、脂質(zhì)代謝和蛋白重編程等[10]。腫瘤微環(huán)境及腫瘤細胞與微環(huán)境之間的交流在腫瘤發(fā)病機制中有基礎(chǔ)作用[11]。肝臟是物質(zhì)代謝的主要器官，對氨基酸合成與分解有執(zhí)行作用，蛋白質(zhì)作為細胞的基本組成部分，由氨基酸合成并能分解氨基酸[12]。氨基酸參與免疫因子的合成，能改善腫瘤免疫微環(huán)境，其活性與肝臟受損程度有關(guān)[13]。肝星狀細胞是肝癌進展最主要的間質(zhì)細胞，對氨基酸代謝起調(diào)節(jié)作用[3]。有研究表明，肝癌患者血清氨基酸譜發(fā)生改變[14]。

固脾消積飲具有益氣化瘀、散結(jié)解毒功效。前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，該方能誘導(dǎo)肝癌細胞焦亡[15]。本實驗通過調(diào)整LX-2細胞和HepG2細胞密度構(gòu)建共培養(yǎng)體系（HepG2∶LX-2=5∶1），該比例接近肝臟微環(huán)境中實質(zhì)細胞與非實質(zhì)細胞的比例，可更準確地模擬肝癌病理生理環(huán)境，同時以單獨培養(yǎng)HepG2細胞作為對照，2個體系培養(yǎng)經(jīng)不同濃度中藥血清處理24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固脾消積飲對單獨培養(yǎng)HepG2細胞和共培養(yǎng)體系HepG2細胞增殖均有抑制作用，能減少TG、TC、葡萄糖含量，增加MDA和丙酮酸含量，降低細胞糖酵解速率。氨基酸檢測結(jié)果表明，10%中藥血清組氨基酸含量明顯低于對照組。由此可見，固脾消積飲對HepG2細胞的抑制作用與調(diào)節(jié)能量代謝和氨基酸代謝有關(guān)，結(jié)合p-AMPKα/AMPKα比值升高，推測固脾消積飲可能通過磷酸化AMPKα通路調(diào)節(jié)HepG2細胞能量代謝，促進細胞凋亡。從本實驗結(jié)果來看，單獨培養(yǎng)的HepG2細胞與LX-2/HepG2共培養(yǎng)體系相比有細微差別，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，初步推測LX-2細胞增強了HepG2細胞抗凋亡能力，肝星狀細胞作為肝纖維化的關(guān)鍵細胞，與HepG2細胞相互影響、相互調(diào)控，今后將繼續(xù)開展深入研究進一步驗證。

綜上所述，固脾消積飲可能通過磷酸化AMPKα通路調(diào)節(jié)肝癌HepG2細胞能量代謝和氨基酸，進而促進細胞凋亡。