李笑笑 ，李姝潔 ，董健健 ，韓永升，

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所，安徽 合肥 230038；3.安徽省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，安徽 合肥 230031

卒中是世界第二大死亡原因，也是全球致殘的主要原因。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是卒中最常見的類型[1-2]，由血管阻塞導(dǎo)致大腦特定區(qū)域血液供應(yīng)減少引起。電針將傳統(tǒng)針刺與生物電刺激相結(jié)合，基礎(chǔ)和臨床研究均表明電針可通過多途徑、多靶點治療IS[3-6]。針刺血清是針刺治療后產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)，有類似于針刺治療的效應(yīng)，具有抑制神經(jīng)元Ca2+超載、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化、上調(diào)神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性、提高海馬神經(jīng)元突觸可塑性、減輕神經(jīng)元損傷等作用[7-10]。

鐵死亡是細(xì)胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)活性氧累積，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和死亡的特殊死亡形式[11]。越來越多的證據(jù)表明，鐵死亡是IS病理性細(xì)胞死亡的重要機制，鐵死亡促進(jìn)IS的發(fā)生，引起腦組織結(jié)構(gòu)和功能損傷，而抑制鐵死亡可以顯著降低IS嚴(yán)重程度并促進(jìn)腦功能恢復(fù)[12-13]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針對IS模型大鼠神經(jīng)血管單元（NVU）具有保護作用，且電針血清干預(yù)可減輕氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（OGD/R）誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，而該作用與激活Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)[14-15]。同時發(fā)現(xiàn)，電針通過抑制鐵死亡對IS模型大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。為進(jìn)一步探究電針對IS鐵死亡的抑制作用及可能機制，本研究利用OGD/R方法構(gòu)建海馬神經(jīng)元體外缺血損傷模型，并予電針大鼠血清干預(yù)，觀察電針血清對海馬神經(jīng)元OGD/R損傷及鐵死亡的影響，為電針治療IS提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物及細(xì)胞

SPF級健康雄性SD大鼠30只，2～3月齡，體質(zhì)量250～300 g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號SCXK（魯）2019-0003。飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，相對濕度50%～60%，12 h光照，自由攝食飲水。HT-22細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（批號8120475），美國Gibco公司；胎牛血清（批號20210506），天津康源；CCK8試劑盒（批號CK04），上海東仁化學(xué)科技有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒（批號CA1410），索萊寶科技有限公司；長鏈脂酰輔酶A合成酶4（ACSL4）抗體（批號384265）、Wnt1多克隆抗體（批號251822），成都正能生物；β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體（批號8480），美國CST公司；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（批號GB113745），武漢賽維爾生物；糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）抗體（批號ab32391）、軸蛋白2（Axin2）抗體（批號ab109307）、運鐵蛋白（Tf）抗體（批號ab82411），英國Abcam公司。

生物安全柜（BSC-1300ⅡA2），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱（GOLD-SIM W200IR），美國SIM公司；熒光倒置相差顯微鏡（CKX41），日本Olympus公司；全波長酶標(biāo)儀（Epoch2），美國Biotek公司；電泳儀（Powerpac Basic），美國伯樂公司；電針儀（G6805-2A），上海華誼醫(yī)用儀器有限公司；一次性無菌針灸針（13 mm×0.18 mm），吳江云龍醫(yī)療器械有限公司。

2 實驗方法

2.1 血清制備

參照前期研究[15]方法制備對照大鼠血清和電針大鼠血清，0.22 μm過濾器過濾，分裝，56 ℃滅活30 min，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模及干預(yù)

將HT-22細(xì)胞分為對照組、模型組和電針血清組。對照組先以15%對照大鼠血清置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后更換為無血清、含糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；模型組先以15%對照大鼠血清正常培養(yǎng)24 h，再以無血清、無糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2、1%O2和94%N2混合氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，后以無血清、含糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h建立OGD/R模型；電針血清組先以15%電針大鼠血清正常培養(yǎng)24 h，再按模型組方法進(jìn)行處理。

2.3 CCK8法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞接種至96孔板，每孔100 μL，按“2.2”項下方法分組處理，每組6個復(fù)孔，另設(shè)空白組（不接種細(xì)胞僅加入培養(yǎng)基）。干預(yù)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK8溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，各組分別吸取100 μL培養(yǎng)液于96孔板中，酶標(biāo)儀波長450 nm測定吸光度，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（電針血清組-空白組）÷（對照組-空白組）×100%。

2.4 活性氧含量檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞接種至放有細(xì)胞爬片的6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個/孔，并按“2.2”項下方法進(jìn)行分組干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，棄去液體，以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，細(xì)胞爬片滴加DAPI染色劑，室溫避光孵育8～10 min，PBS漂洗3次，使用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察，使用Image J軟件分析平均熒光強度。

2.5 Western blot檢測

干預(yù)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，分別加入PMSF和RIPA裂解液吹打混合，冰浴搖床上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱8 min，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ?2%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，快速封閉液搖床常溫封閉20 min，加入β-actin、ACSL4、 Tf、 GPX4、 Wnt1、 β -catenin、 Axin2、GSK-3β一抗（均為1∶1 000），室溫?fù)u床孵育4 h，PBST洗膜3次，加二抗（1∶10 000），室溫?fù)u床孵育1.5 h，使用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值計算蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 電針血清對HT-22細(xì)胞存活率的影響

與對照組比較，模型組HT-22細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01）。見表1。

表1 各組HT-22細(xì)胞存活率比較（±s，%）

表1 各組HT-22細(xì)胞存活率比較（±s，%）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 6 6 6存活率100.00± 5.37 56.04± 6.81**71.87±10.05##

4.2 電針血清對HT-22細(xì)胞活性氧含量的影響

與對照組比較，模型組HT-22細(xì)胞ROS含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細(xì)胞ROS含量顯著減少（P<0.01）。見表2。

表2 各組HT-22細(xì)胞ROS含量比較（±s，平均熒光強度）

表2 各組HT-22細(xì)胞ROS含量比較（±s，平均熒光強度）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 3 3 3 ROS 2.04±0.37 44.59±2.47**17.59±2.08##

4.3 電針血清對HT-22細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組HT-22細(xì)胞ACSL4、Tf蛋白表達(dá)升高，GPX4蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細(xì)胞ACSL4、Tf蛋白表達(dá)降低，GPX4蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖1、表3。

圖1 各組HT-22細(xì)胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白免疫印跡

表3 各組HT-22細(xì)胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組HT-22細(xì)胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 3 3 3 ACSL4 0.141±0.003 0.316±0.002**0.096±0.003##Tf 0.635±0.006 0.665±0.004**0.383±0.002##GPX4 1.021±0.013 0.500±0.009**0.643±0.001##

4.4 電針血清對HT-22細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組HT-22細(xì)胞Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低，Axin2、GSK-3β蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細(xì)胞Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高，Axin2、GSK-3β蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表4、圖2。

圖2 各組HT-22細(xì)胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白免疫印跡

表4 各組HT-22細(xì)胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組HT-22細(xì)胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 3 3 3 Wnt1 0.639±0.015 0.524±0.008**0.612±0.010##β-catenin 1.024±0.028 0.846±0.014**0.986±0.033##Axin2 0.649±0.012 0.878±0.013**0.662±0.020##GSK-3β 0.633±0.017 0.787±0.018**0.599±0.021##

5 討論

研究發(fā)現(xiàn)，以鐵超載、谷胱甘肽（GSH）消耗和GPX4失活、脂質(zhì)過氧化、Xc-系統(tǒng)損傷及線粒體膜密度增加、嵴破裂或消失等為特征的鐵死亡在IS發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[17]。大腦中動脈閉塞（MCAO）模型大鼠大腦皮質(zhì)出現(xiàn)鐵和ROS沉積，血清脂質(zhì)過氧化水平明顯升高，并伴有鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)異常[18]。OGD/R能顯著增加神經(jīng)元內(nèi)鐵和ROS含量，線粒體出現(xiàn)膜密度增加和嵴減少[19]，而應(yīng)用鐵死亡抑制劑如Liproxstatin-1可顯著減少鐵沉積和ROS生成，降低脂質(zhì)過氧化水平，保護OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[20]。臨床應(yīng)用去鐵胺能降低急性IS患者體內(nèi)鐵含量和運鐵蛋白飽和度，減輕神經(jīng)損傷，改善預(yù)后[21]。

ROS累積是鐵死亡的標(biāo)志之一，鐵死亡抑制劑和各種抗氧化劑或ROS清除劑都可以抑制ROS累積和細(xì)胞鐵死亡[22]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)鐵和ROS沉積，介導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡[20，23-24]。本實驗及前期研究結(jié)果[14]顯示，OGD/R后神經(jīng)元內(nèi)ROS水平升高、丙二醛（MDA）含量增加、超氧化物歧化酶（SOD）活性減弱，提示OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)ROS生成和氧化應(yīng)激發(fā)生。在電針大鼠血清干預(yù)下，ROS水平降低，MDA含量減少、SOD活性增強，提示電針大鼠血清能抑制ROS產(chǎn)生，減輕氧化損傷。

ACSL4和GPX4被認(rèn)為是鐵死亡的正、負(fù)調(diào)節(jié)因子。ACSL4是多不飽和脂肪酸（PUFA）代謝的同工酶[25]，通過催化PUFA乙?；?，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致鐵死亡[26]。ACSL4過表達(dá)促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生，而抑制ACSL4可減輕鐵死亡[27-28]。GPX4是一種硒過氧化物酶，利用GSH作為輔助因子，將有毒的脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇，以維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[29]，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化抑制細(xì)胞鐵死亡。Tf是血清中的一種鐵載體蛋白，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將鐵轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中[30]，Tf的激活促進(jìn)鐵死亡發(fā)生[31]。本實驗發(fā)現(xiàn)，OGD/R誘導(dǎo)HT-22細(xì)胞ACSL4、Tf蛋白表達(dá)升高，GPX4蛋白表達(dá)降低，結(jié)合ROS含量增加和細(xì)胞存活率降低，提示OGD/R能誘導(dǎo)神經(jīng)元鐵死亡。電針血清干預(yù)后，HT-22細(xì)胞ACSL4、Tf蛋白表達(dá)降低，GPX4蛋白表達(dá)升高，并伴有ROS含量減少和細(xì)胞存活率升高，提示電針血清對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡具有抑制作用。

Wnt信號通路是一條進(jìn)化上保守的細(xì)胞間信息傳遞通路，與胚胎發(fā)生和干細(xì)胞更新，細(xì)胞增殖、分化等緊密相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，有效保護MCAO大鼠NVU[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在電針大鼠血清干預(yù)后，HT-22細(xì)胞Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，Axin2、GSK-3β蛋白表達(dá)下調(diào)，提示電針大鼠血清可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制神經(jīng)元鐵死亡。

綜上所述，電針大鼠血清對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷的保護作用可能與激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制細(xì)胞鐵死亡相關(guān)。