王婷婷，李鑫輝，戴超男，李彩云

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是人類死亡的主要病因之一，臨床治療應(yīng)盡早恢復(fù)缺血心肌血流灌注[1]，但短時間內(nèi)迅速恢復(fù)血流會出現(xiàn)更嚴(yán)重的損傷，即心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。研究表明，在AMI的最終梗死面積中，約50%由缺血再灌注損傷造成[2]。再灌注期間，過度自噬導(dǎo)致自噬體大量積累及關(guān)鍵蛋白和細(xì)胞器異常降解，進(jìn)而損傷細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性凋亡[3-5]。因此，調(diào)節(jié)自噬對減輕MIRI有重要作用[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參通絡(luò)解毒湯能通過下調(diào)MALAT1基因表達(dá)，抑制缺氧/復(fù)氧大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）自噬[7-8]。研究表明，SRPK1對MIRI有保護(hù)作用[9]。本研究以MALAT1調(diào)節(jié)CMECs自噬為切入點(diǎn)，進(jìn)一步明確丹參通絡(luò)解毒湯調(diào)節(jié)缺氧/復(fù)氧損傷CMECs自噬的作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞及動物

CMECs，武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量220～250 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號SYXK（湘）2019-0004，常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（LL2019101604）。

1.2 藥物及制備

丹參通絡(luò)解毒湯（丹參15 g，玄參15 g，當(dāng)歸10 g，黃連6 g，梔子15 g，生地黃15 g，麥冬12 g，金銀花10 g，連翹10 g，黃芪30 g），飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。按前期方法[7]制備成含原藥材4 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

CMECs完全培養(yǎng)基（武漢普諾賽，貨號CMR135），RNA免疫沉淀試劑盒（美國Sigma，貨號RIP），TRIzol（美國Thermo，貨號15596026），RIPA裂解液（上海碧云天，貨號P0013B），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京康為世紀(jì)，貨號CW0014S），顯影液（上海佳信，貨號BW-61），SRPK1抗體（英國Abcam，貨號ab90527），Beclin1抗體（英國Abcam，貨號ab92389），Bcl-2抗體（英國Abcam，貨號ab59348），Bax抗體（英國Abcam，貨號ab182733），LC3B抗體（美國Proteintech，貨號18725-1-AP），GAPDH抗體（美國Proteintech，貨號10494-1-AP），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)，貨號CW2569）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo，型號STERI-CYCLE i250），生物安全柜（美國Thermo，型號1300 SERIES A2），熒光定量PCR儀（美國Thermo，型號PIKOREAL96），搖床（江蘇其林貝爾，型號TS-1），電泳儀（北京六一，型號DYY-2C），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國勤翔，型號ChemiScope6100），倒置熒光顯微鏡（廈門Motic，型號BA210T）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清制備

20只大鼠隨機(jī)分為對照組和丹參通絡(luò)解毒湯組，每組10只。丹參通絡(luò)解毒湯組按臨床等效劑量15.66 g/（kg·d）灌胃，對照組灌胃等體積蒸餾水，每日2次，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，4 ℃靜置4 h，3 000 r/min離心15 min，取血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 缺氧/復(fù)氧模型制備

細(xì)胞用完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，生長至80%～90%時用于實(shí)驗(yàn)。按課題組前期方法[10]造模：棄去原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，替換成無血清、不含糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，氣體體積分?jǐn)?shù)為94%N2、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧2 h，更換為完全培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中復(fù)氧2 h。

2.3 RNA免疫共沉淀檢測

取對數(shù)生長期CMECs，胰酶消化，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分為空白組和模型組，空白組常規(guī)培養(yǎng)，模型組按“2.2”項(xiàng)下方法造模。收集空白組和模型組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，一部分裂解產(chǎn)物作為對照（Input），一部分用于與非特異性IgG結(jié)合，一部分用于與SRPK1抗體結(jié)合。免疫磁珠對裂解產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)清除，將5 μg IgG和SRPK1抗體（1∶2 000）分別加入裂解產(chǎn)物中，4 ℃孵育過夜，加50 μL免疫磁珠混勻，4 ℃孵育2 h，收集免疫磁珠，TRIzol法抽提總RNA，并進(jìn)行RT-PCR，以IgG/Input及SRPK1/Input的MALAT1表達(dá)量評價IgG和SRPK1與MALAT1結(jié)合能力。上游引物：5'-GGGGGAATGGGGGCAAAATA-3'，下游引物：5'-AACTACCAGCAATTCCGCCA-3'，產(chǎn)物長度213 bp。

2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染

取生長狀態(tài)良好的CMECs，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，當(dāng)細(xì)胞貼壁融合至20%～30%，根據(jù)吉凱基因重組慢病毒載體使用手冊進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，加入計(jì)算好的病毒液（感染指數(shù)50），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)11 h，棄去培養(yǎng)液，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)37 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率80%時效果最佳。

2.5 細(xì)胞分組及處理

取對數(shù)生長期CMECs，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個/mL，接種于6孔板，先按“2.2”項(xiàng)下方法造模，再按“2.4”項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染MALAT1沉默慢病毒，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，將細(xì)胞分為過表達(dá)SRPK1組（以SRPK1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs后，加入對照血清培養(yǎng)基干預(yù)24 h）、過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組（以SRPK1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs后，加入丹參通絡(luò)解毒湯含藥血清培養(yǎng)基干預(yù)24 h）、空載組（以空載慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs后，加入對照血清培養(yǎng)基干預(yù)24 h）、空載聯(lián)合含藥血清組（以空載慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs后，加入丹參通絡(luò)解毒湯含藥血清培養(yǎng)基干預(yù)24 h），根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]，使用15%含藥血清。

2.6 Western blot檢測

干預(yù)結(jié)束后加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加Bcl-2一抗（1∶500）、Bax一抗（1∶2 000）、LC3B一抗（1∶300）、Beclin1一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶3 000），4 ℃孵育過夜，加二抗室溫孵育90 min，ECL顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

2.7 RT-PCR檢測

干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用于熒光定量PCR，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法分析各基因相對表達(dá)量。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.8 免疫熒光染色

干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞，將TC處理的細(xì)胞爬片放入浸潤好的6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個/mL，接種于爬片，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定爬片，加入0.3%Triton X-100，37 ℃通透30 min，PBS洗3次，每次3 min，滴加5%BSA封閉1 h，滴加LC3B一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，次日加入熒光二抗，37 ℃孵育90 min，PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI染細(xì)胞核，37 ℃孵育10 min，緩沖甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，應(yīng)用Image J軟件對圖片進(jìn)行半定量分析，測量平均熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，方差齊多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 MALAT1與SRPK1結(jié)合情況驗(yàn)證

利用IgG及SRPK1抗體結(jié)合免疫磁珠富集總RNA后進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，與同組IgG/Input比較，空白組和模型組與SRPK1抗體結(jié)合的MALAT1顯著升高（P<0.01），見表2。表明MALAT1與SRPK1蛋白存在特異性結(jié)合。

表2 IgG、SRPK1與MALAT1結(jié)合能力比較（±s）

表2 IgG、SRPK1與MALAT1結(jié)合能力比較（±s）

注：與同組IgG/Input比較，**P<0.01

SRPK1/Input組別n IgG/Input 2.63±0.03**2.60±0.22**空白組模型組3 3 1.00±0.08 0.81±0.21

4.2 丹參通絡(luò)解毒湯含藥血清對細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與過表達(dá)SRPK1組比較，過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組和空載組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01，P<0.05），Bax、Beclin1蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著降低（P<0.01）；與過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組比較，空載聯(lián)合含藥血清組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），Bax、Beclin1蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著降低（P<0.01）；與空載組比較，空載聯(lián)合含藥血清組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），Bax、Beclin1蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著降低（P<0.01）。見表3、圖1。

表3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Beclin1蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值比較（±s）

表3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Beclin1蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值比較（±s）

注：與過表達(dá)SRPK1組比較，*P<0.05，**P<0.01；與過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組比較，##P<0.01；與空載組比較，&&P<0.01

組別過表達(dá)SRPK1組過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組空載組空載聯(lián)合含藥血清組n3 3 3 3 Bcl-2 0.11±0.02 0.20±0.04*0.31±0.01**0.44±0.03##&&Bax 0.40±0.07 0.30±0.04**0.23±0.03**0.11±0.02##&&LC3BⅡ/LC3BⅠ1.00±0.30 0.36±0.01*0.23±0.02*0.07±0.01##&&Beclin1 1.00±0.03 0.70±0.03**0.52±0.02**0.20±0.04##&&

圖1 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Beclin1、LC3B蛋白免疫印跡

4.3 丹參通絡(luò)解毒湯含藥血清對細(xì)胞LC3B mRNA表達(dá)的影響

與過表達(dá)SRPK1組比較，過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組和空載組細(xì)胞LC3B mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組比較，空載聯(lián)合含藥血清組細(xì)胞LC3B mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01）；與空載組比較，空載聯(lián)合含藥血清組細(xì)胞LC3B mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見表4。

表4 各組細(xì)胞LC3B mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組細(xì)胞LC3B mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與過表達(dá)SRPK1組比較，*P<0.05；與過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組比較，##P<0.01；與空載組比較，&&P<0.01

組別過表達(dá)SRPK1組過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組空載組空載聯(lián)合含藥血清組n 3 3 3 3 LC3B 1.00±0.01 0.66±0.02*0.55±0.02*0.40±0.02##&&

4.4 丹參通絡(luò)解毒湯含藥血清對細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)的影響

與過表達(dá)SRPK1組比較，過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組和空載組細(xì)胞LC3B表達(dá)降低（P<0.01）；與過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組比較，空載聯(lián)合含藥血清組細(xì)胞LC3B表達(dá)降低（P<0.01）；與空載組比較，空載聯(lián)合含藥血清組細(xì)胞LC3B表達(dá)降低（P<0.01）。見圖2、表5。

圖2 各組細(xì)胞LC3B陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

表5 各組細(xì)胞LC3B表達(dá)比較（±s，平均熒光強(qiáng)度）

表5 各組細(xì)胞LC3B表達(dá)比較（±s，平均熒光強(qiáng)度）

注：與過表達(dá)SRPK1組比較，**P<0.01；與過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組比較，##P<0.01；與空載組比較，&&P<0.01

組別過表達(dá)SRPK1組過表達(dá)SRPK1聯(lián)合含藥血清組空載組空載聯(lián)合含藥血清組n 3 3 3 3 LC3B 77.42±1.51 56.96±3.35**42.81±2.24**31.36±1.19##&&

5 討論

AMI屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”“真心痛”等范疇。胸痹與熱、毒、瘀關(guān)系密切，火熱瘀結(jié)，毒損心營，引發(fā)胸痹、心痛[11-12]。丹參通絡(luò)解毒湯由李鑫輝教授根據(jù)《溫病條辨》清營湯和《時方歌括》丹參飲化裁而成，具有活血通絡(luò)、清營解毒、益氣養(yǎng)陰功效。前期藥理研究表明，該方可減輕MIRI大鼠心肌細(xì)胞損傷，保護(hù)受損心肌細(xì)胞，其機(jī)制與抑制自噬有關(guān)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以沉默MALAT1抑制缺氧/復(fù)氧損傷CMECs自噬為切入點(diǎn)，進(jìn)一步明確丹參通絡(luò)解毒湯調(diào)節(jié)缺氧/復(fù)氧損傷CMECs自噬的作用機(jī)制。

MALAT1是一種長鏈非編碼RNA，在哺乳動物中含量非常豐富，且在全長范圍內(nèi)高度保守，在人和鼠2個物種之間，MALAT1的高度同源序列位于其3'端[15-17]。MALAT1在調(diào)節(jié)心臟功能上發(fā)揮重要作用[18]，其高表達(dá)被認(rèn)為是AMI新的生物標(biāo)志物[19]。SRPK1/2抑制劑能減輕心肌缺血再灌注所致大鼠心臟損傷，保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞株內(nèi)，MALAT1與SRPK1蛋白存在相互作用[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺氧/復(fù)氧刺激下，大鼠CMECs中MALAT1與SRPK1蛋白同樣存在特異性結(jié)合。

基礎(chǔ)水平的自噬是對壓力的保護(hù)性反應(yīng)，通過清除受損的蛋白質(zhì)和老化的細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。再灌注階段自噬相關(guān)因子表達(dá)升高，導(dǎo)致過度自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡，加重心肌細(xì)胞凋亡[22]。因此，適當(dāng)調(diào)控自噬有助于防治MIRI。Beclin1和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值可用于反映自噬程度，Bcl-2和Bax是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的最主要因子。有研究顯示，缺氧/復(fù)氧損傷可上調(diào)小鼠心肌細(xì)胞MALAT1基因表達(dá)[23-24]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，丹參通絡(luò)解毒湯能通過下調(diào)MALAT1基因表達(dá)抑制TLR4/NF-κB信號通路，降低自噬水平，保護(hù)心肌組織[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在沉默MALAT1基礎(chǔ)上過表達(dá)SRPK1，缺氧/復(fù)氧損傷CMECs Beclin1和Bax蛋白表達(dá)、LC3B mRNA和蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，提示過表達(dá)SRPK1可逆轉(zhuǎn)沉默MALAT1對缺氧/復(fù)氧損傷CMECs自噬及凋亡的抑制作用。在沉默MALAT1基礎(chǔ)上過表達(dá)SRPK1，再予丹參通絡(luò)解毒湯含藥血清干預(yù)，缺氧/復(fù)氧損傷CMECs Beclin1和Bax蛋白表達(dá)、LC3B mRNA和蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，表明丹參通絡(luò)解毒湯可抑制缺氧/復(fù)氧損傷CMECs自噬與凋亡。而僅在沉默MALAT1基礎(chǔ)上予丹參通絡(luò)解毒湯含藥血清干預(yù)，缺氧/復(fù)氧損傷CMECs Beclin1和Bax蛋白表達(dá)、LC3B mRNA和蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值最低，Bcl-2蛋白表達(dá)最高，說明丹參通絡(luò)解毒湯能通過下調(diào)MALAT1、抑制SRPK1表達(dá)，抑制缺氧/復(fù)氧損傷CMECs自噬和凋亡。

綜上所述，丹參通絡(luò)解毒湯抑制缺氧/復(fù)氧損傷CMECs自噬、保護(hù)CMECs作用可能與下調(diào)MALAT1、抑制SRPK1表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果可為中醫(yī)藥防治AMI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。