李利山，劉玉香，韓斌*

（1.榆林市畜牧獸醫(yī)服務中心 陜西榆林 719000；2.佳縣畜牧服務中心 陜西榆林 719200）

豬瘟（classical swine fever，CSF）俗稱“爛腸瘟”“豬霍亂”，是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染性疾病之一，為我國一類動物疫病[1]，主要表現(xiàn)為出血和發(fā)熱，任何年齡、品種、性別的豬和野豬均可發(fā)病，高死亡率，對生豬養(yǎng)殖場造成的損害大[2]。豬瘟首次報道于1810 年，1833 年在美國首次暴發(fā)，1935 年在我國開始流行。1912年研究表明采用高免血清和攜有豬瘟病毒的血液共同對豬免疫具有一定的保護效果，但有一定的散毒風險[3]。1936 年美國研發(fā)出了豬瘟結(jié)晶紫滅活疫苗，1943 年全世界開始推廣使用豬瘟結(jié)晶紫滅活疫苗，1951—1955 年我國開始使用結(jié)晶紫滅活疫苗對豬進行免疫。豬瘟結(jié)晶紫滅活疫苗由于產(chǎn)生免疫能力慢、免疫保護期短、需要培養(yǎng)強毒株、疫苗散布豬瘟風險大和生產(chǎn)成本高等原因在1982年開始停止生產(chǎn)。20 世紀70 年代—80 年代豬瘟原代細胞疫苗、2005 年豬瘟豬睪丸傳代細胞疫苗、2018 年新型豬瘟疫苗基因工程亞單位疫苗等相繼研究獲得成功并開始推廣使用[4]。據(jù)報道2020 年我國市場上共有60 余家生產(chǎn)企業(yè)獲得豬瘟疫苗政府生產(chǎn)批文，批簽發(fā)總數(shù)在1,400 多批。目前人們使用和研究的豬瘟疫苗主要為弱毒疫苗和新型豬瘟疫苗。

1 弱毒疫苗

1946 年，國外研究者開始研制豬瘟病毒減弱的變異毒株。1950年，我國研究者培育出了一株免疫效果較好的豬瘟兔化弱毒株（C株或HCLV 株），它是石門系（shimen）強毒株通過大耳白兔傳430代，歷經(jīng)4 年多研究成功的致弱疫苗株，由于其具有很好的安全性和免疫性，1956 年開始在國內(nèi)推廣使用，是我國主要使用的豬瘟疫苗毒株。到目前為止，豬瘟弱毒疫苗可分為動物組織源弱毒疫苗和細胞源弱毒疫苗。

1.1 動物組織源弱毒疫苗

從1957 開始使用成年兔脾臟及淋巴結(jié)（簡稱脾淋）組織弱毒疫苗，該疫苗是將豬瘟兔化弱毒株接種到兔體內(nèi)，然后采集感染豬瘟病毒兔子的脾臟和淋巴結(jié)進行加工制備而成，據(jù)報道，每只成年兔可制成豬瘟疫苗300 頭劑左右[5,6]。1964 年開始使用3～5 日齡的乳兔組織制備弱毒疫苗，1965 年研究者們發(fā)現(xiàn)將豬瘟病毒接種到1～2 歲的易感牛體內(nèi)后，采集淋巴結(jié)和脾臟組織制成組織疫苗，免疫效果與兔的組織苗效果相似，并在部分區(qū)域開始應用，但由于使用牛成本高，疫苗效果不穩(wěn)定，到2005 年后便逐漸減少使用。截至目前豬瘟組織疫苗主要還是成年兔和乳兔的組織弱毒疫苗。兔源組織源疫苗抗體產(chǎn)生快，免疫保護期長，疫苗中含有增強免疫因子，能夠增強免疫效果，常用于緊急免疫[7]；不足之處為生產(chǎn)成本高，適宜制作疫苗的兔源減少，不同批次家兔產(chǎn)出疫苗抗原含量有變化，在儲運時均需在-15℃的條件下冷凍保存，實際應用中疫苗容易失活，造成免疫效果參差不齊，為此研究者們研發(fā)出了兔源豬瘟耐熱保護劑活疫苗，這類疫苗加有耐熱保護劑，生產(chǎn)出的豬瘟疫苗可在2～8℃環(huán)境中儲存，且保存時間能夠達到18 個月以上。

目前市場上也有售豬瘟多聯(lián)疫苗，如豬瘟三聯(lián)（豬瘟-豬丹毒-豬多殺性巴氏桿菌）弱毒疫苗（兔源+G4T10 株/GC42 株+EO630株），此疫苗是將豬瘟兔化弱毒株接種到乳兔體內(nèi)，然后摘取含有病毒的乳兔組織進行研磨，再將豬丹毒桿菌弱毒液和豬源多殺性巴氏桿菌弱毒菌液進行混合制備而成。此類疫苗制備工藝要求較高，需要在豬瘟乳兔組織培養(yǎng)物中不含青霉素和鏈霉素。

1.2 細胞源弱毒疫苗

主要有乳豬腎細胞苗、羊腎細胞苗、犢牛睪丸原代細胞苗、豬睪丸傳代細胞苗（swine testis cells，ST 細胞）、牛睪丸細胞傳代細胞苗（bovine testis cells，BT 細胞）。

1）豬瘟原代細胞苗。將豬瘟病毒接種到原代細胞中培養(yǎng)，然后收毒制成凍干苗。2020 年獲得政府批簽發(fā)總數(shù)500 多批。1974 年研究者通過乳豬腎原代細胞成功研究出了豬瘟細胞源疫苗，1980年通過綿羊腎原代細胞制出了豬瘟綿羊腎原代細胞源疫苗，1982年通過奶山羊腎原代細胞制出了豬瘟奶山羊腎原代細胞源疫苗，1985 年研究者使用犢牛睪丸原代細胞制成了豬瘟牛睪丸原代細胞源疫苗。

豬瘟原代細胞苗優(yōu)點是生產(chǎn)成本較低，生產(chǎn)量大，批間抗原含量好控制，價格便宜。不足的地方為免疫后抗體產(chǎn)生較慢，抗體量低，免疫時需要加大免疫劑量。另外如使用牛睪丸原代細胞培養(yǎng)，有牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）影響的風險，從而影響疫苗穩(wěn)定性。

2）豬瘟傳代細胞苗。傳代細胞苗是用豬瘟病毒兔化弱毒株接種到易感傳代細胞培養(yǎng)得到的。2020 年豬瘟傳代細胞疫苗獲得政府批簽發(fā)總數(shù)為500 多批。2005 年研究者使用豬睪丸傳代細胞制成了豬瘟傳代細胞源疫苗，2008 年我國有16 個省市開始推廣使用，是目前應用最多的一種弱毒傳代細胞疫苗。使用豬睪丸傳代細胞避免了異源細胞培養(yǎng)問題，且可以傳代培養(yǎng)，抗原含量高，減少了使用牛血清帶來的BVDV 污染問題[8]。在母源抗體較高的情況下免疫豬瘟傳代細胞源疫苗，容易產(chǎn)生免疫失敗現(xiàn)象，因此在免疫前需要對仔豬的豬瘟母源抗體水平進行監(jiān)測。

目前我國豬瘟傳代細胞疫苗主要由以下單位或企業(yè)研發(fā)成功，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2012 年通過了中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所申請的豬瘟豬睪丸傳代細胞苗，2015 年通過了華威特（北京）生物科技有限公司使用牛睪丸（BT）傳代細胞制備的豬瘟二聯(lián)活疫苗（豬瘟+豬藍耳），2020 年通過了軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所使用PK/WRL 傳代細胞制備的豬瘟傳代細胞苗[9]。

豬瘟傳代細胞苗多聯(lián)苗有豬瘟二聯(lián)弱毒疫苗（豬瘟-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征），該疫苗是將豬瘟兔化弱毒C 株接種到牛睪丸傳代細胞培養(yǎng)后制成的疫苗，目前已上市。使用該種疫苗進行免疫能夠減少免疫次數(shù)，減少豬只的應激反應和工人勞動成本，但對于已經(jīng)感染豬瘟病毒的豬只或已經(jīng)免疫過豬瘟病毒疫苗的豬只來說并不能夠產(chǎn)生很好的保護效果。

2 新型豬瘟疫苗

新型豬瘟疫苗主要有亞單位疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、基因缺失苗和反式互補缺失突變疫苗[10]。

2.1 亞單位疫苗

豬瘟亞單位疫苗是指將豬瘟囊膜蛋白基因通過原核表達系統(tǒng)或真核系統(tǒng)進行表達成為蛋白對豬進行免疫。豬瘟病毒有3 種囊膜蛋白，分別為Erns（E0）、E1 和E2，結(jié)構(gòu)糖蛋白-E2 蛋白，是豬瘟病毒侵入機體細胞的重要蛋白[11]，具有很好的免疫原性，能夠誘導機體產(chǎn)生相應抵抗病毒抗體，因而為許多研究團隊所重視。研究者們使用畢赤酵母、腺病毒、轉(zhuǎn)基因哺乳動物細胞、桿狀病毒和基因工程乳桿菌等表達E2 亞單位疫苗。有研究者通過使用HEK293T重組細胞表達出了免疫原性較E2 蛋白更好的E2-GM-CSF 融合蛋白為豬瘟疫病的防控提供了新型E2 亞單位疫苗[12]。顏仁和等[13]通過細胞系HEK-293T-E2 制備出豬瘟E2 亞單位疫苗，該疫苗能夠誘導兔和仔豬產(chǎn)生豬瘟病毒抗體，能夠抵抗豬瘟病毒石門株的攻擊，仔豬阻斷率在80%以上。高瑩等[14]以豬瘟病毒E2 基因序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建出了重組桿狀病毒rAc-HE2oKm，對仔豬進行免疫后能夠產(chǎn)生高水平的抗體，免疫效果與豬瘟活疫苗相當。王遵寶等[15]通過桿狀病毒感染昆蟲細胞后表達出E2 蛋白（Bac-E2），使用該亞單位疫苗對豬進行免疫發(fā)現(xiàn)Bac-E2 能夠誘導豬產(chǎn)生較高的豬瘟中和抗體，免疫組在豬瘟病毒的攻擊下保護率達到100%。

德國拜耳公司和荷蘭英特威公司已通過兩種桿狀病毒表達出E2 蛋白亞單位疫苗，具有安全性，免疫原性好的特點，目前已經(jīng)上市。我國天康生物股份有限公司在桿狀病毒上重組豬瘟病毒E2 基因，然后在昆蟲細胞上進行表達的亞單位疫苗（Rb-03 株）[16]。該疫苗在我國2017 年注冊完成，2018 年開始生產(chǎn)使用。免疫實驗表明經(jīng)過兩次免疫后，能夠有效避免豬瘟病毒的傷害[17]。2020 年華中農(nóng)業(yè)大學和一些企業(yè)合作研發(fā)出了豬瘟病毒E2 蛋白重組桿狀病毒亞單位疫苗（WH-09 株），完成官方疫苗注冊時間為2020 年，政府批簽發(fā)數(shù)量12 批。該疫苗利用昆蟲細胞-重組桿狀病毒系統(tǒng)表達豬瘟E2 蛋白的基因工程亞單位疫苗，具有安全性好、穩(wěn)定性強的特點。

2.2 活載體疫苗

活載體重組疫苗被許多研究者認為是潛力較大的一類豬瘟疫苗，主要使用的載體病毒有牛病毒性腹瀉病毒、痘病毒、偽狂犬病病毒和豬腺病毒[18]。

2014 年歐洲藥品管理局批準上市了牛病毒性腹瀉病毒載體疫苗CP_E2alf 疫苗，CP7-E2alf 疫苗與弱毒活疫苗一樣安全有效，防止了豬瘟病毒的垂直傳播[19]。Voigt 等[20]使用重組口瘡病毒ORFV VrV-E2 對豬進行免疫，結(jié)果表明具有很好的保護效果。李譜華等[21]將豬瘟病毒抗原較好的E2 基因構(gòu)建到雞痘病毒表達載體FPVP11 上，然后重組出雞痘病毒FV282-CSFV-E2.對小鼠和豬分別進行了免疫，采用豬瘟病毒強毒株進行攻擊，結(jié)果表明疫苗保護率在75%左右。楊玉艾等[22]利用腺病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PAdEasy-E0-E2構(gòu)建出重組腺病毒rAd-E0-E2，對45 周齡的豬進行2 次免疫，使用豬瘟毒株進行攻毒，研究表明疫苗免疫保護率達到86%。梁易曉等[23]研究表明重組豬瘟腺病毒rAd-E0-E2 株活載體疫苗，能在短時間內(nèi)通過細胞免疫或黏膜免疫等途徑保護豬，免疫保護期至少為7 個月。韓爽等[24]重組出含有豬瘟E2 基因的重組偽狂犬病病毒PRV-CSFV PE2SC，該重組載體具有穩(wěn)定遺傳的能力，對豬瘟和豬偽狂犬病能夠同時預防。

2.3 核酸疫苗

將豬瘟病毒基因構(gòu)建到真核表達載體中然后使用該疫苗對動物進行免疫。郭抗抗等[25]構(gòu)建出了含有豬瘟E2 基因的表達載體pSCA1-E2 質(zhì)粒，使用核酸疫苗對小鼠和豬進行免疫，表明小鼠淋巴細胞增高，免疫豬能夠產(chǎn)生豬瘟特異性抗體。有研究者使用DNA疫苗pSFV1SC-E2 對豬進行免疫后能夠有較好的細胞免疫保護效果[26]。Andrew[27]將豬瘟病毒E2 基因組裝到質(zhì)粒上對豬進行免疫后能夠產(chǎn)生一定的免疫效果。

2.4 合成肽疫苗

根據(jù)病原體基因組核苷酸序列推導出該病原體基因所要表達出的寡肽，然后制備成為疫苗對豬進行免疫。Zhou 等[28]合成了豬瘟E2基因所表達蛋白的B 細胞線性表位RE2-A 和RE2-B，使用該疫苗兩次免疫后，動物機體能夠產(chǎn)生相應抗體。Tian 等[29]構(gòu)建了多個E2蛋白抗原表位的多肽苗，使用該疫苗能夠很好的保護豬只。

2.5 基因缺失苗

有研究者將E2 蛋白抗原表位WH303 上的氨基酸進行突變，作為候選標記疫苗，能夠區(qū)別疫苗免疫與非免疫。也有研究者構(gòu)建了疫苗安全性好E0 缺失突變株，缺少66 個氨基酸的FL22 株和缺少215 個氨基酸的FL23 株[30]。

2.6 反式互補缺失突變疫苗

這類疫苗主要是在CSFV 的Erns 或E2 的反式互補缺失突變體，結(jié)構(gòu)基因被外源基因代替。中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)的腺病毒甲病毒復制嵌合載體疫苗rAdV-SFV-E2 最具潛力，能夠抵抗豬瘟病毒強毒的感染[18]。仔豬免疫后也具有很好的保護效果，能夠不受母源抗體影響，具有很好的保護效果，該疫苗和豬偽狂犬疫苗聯(lián)合免疫時免疫效果能夠不被干擾影響。

3 展望

目前最有效預防豬瘟的方法為疫苗免疫。弱毒疫苗免疫豬只后無法區(qū)分豬瘟毒株是來自疫苗免疫還是外界感染，免疫失敗也時有發(fā)生，相比較之下，新型豬瘟疫苗具有安全性、穩(wěn)定性、可識別性和疫苗生產(chǎn)、儲存和運輸成本低等優(yōu)點，同時伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展和研究者們對豬瘟病毒的不斷了解，新型豬瘟病毒疫苗終將會在豬瘟凈化上發(fā)揮巨大的作用?！?/p>