肖 明，胡琦敏，龐曉云，陳曉藝，譚安薔，李清平，羅宇東

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)百年樂(lè)制藥有限公司，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧 530022）

藤苦參又名馬蓮鞍、古羊藤、南苦參、地苦參等，系蘿藦科杠柳亞科馬蓮鞍屬植物馬蓮鞍（Streptocaulon griffithiiHook.f.），多產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)、云南省、貴州省，生長(zhǎng)于山野坡地、山谷疏林中或路旁灌木叢中。藤苦參的干燥根入藥，可用于治療痢疾、濕熱腹瀉、心胃氣痛、感冒發(fā)燒、慢性腎炎、跌打等疾?。?-3］。作為廣西中醫(yī)藥大學(xué)百年樂(lè)制藥有限公司的獨(dú)家產(chǎn)品外感風(fēng)痧系列產(chǎn)品的主藥材，藤苦參的生產(chǎn)需求大，為保證藥材的來(lái)源及產(chǎn)量，需要進(jìn)行大面積人工種植。本研究在種子繁殖基礎(chǔ)上開展組培繁殖，探索不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)藤苦參無(wú)菌苗不定芽增殖、生根等的影響，篩選出適宜藤苦參種子萌發(fā)條件及組培繁殖培養(yǎng)基配方，以期為藤苦參種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藤苦參種子為野外采集，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室鑒定為蘿藦科杠柳亞科馬蓮鞍屬植物馬蓮鞍的種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌 將藤苦參果莢未開裂的果實(shí)用自來(lái)水沖洗，在超凈工作臺(tái)上，將清洗過(guò)的果莢置于培養(yǎng)皿中，切開果莢取出種子，用75%乙醇浸泡20 s，無(wú)菌水沖洗1 次，加0.1%升汞，浸泡12 min，用無(wú)菌水沖洗4～5 次，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 添加不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）、30 g/L 食用蔗糖、1 g/L活性炭、7 g/L 瓊脂，滅菌前pH 6.5，配置分裝后，在121°C 溫度下滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照度1 000～1 200 lx，每天光照12 h。

1.2.4 種子萌發(fā)培養(yǎng) 將種子播種于MS 培養(yǎng)基中，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、1 g/L 活性炭，20 d后觀察種子的萌發(fā)情況。

1.2.5 叢生芽分化培養(yǎng) 將種子萌發(fā)培養(yǎng)獲得的芽苗接種于不同的叢生芽分化培養(yǎng)基中，以MS 為基本培養(yǎng)基，比較不同濃度的6-BA 和NAA 對(duì)藤苦參芽增殖分化的影響，40 d 后觀察芽的增殖分化情況。

1.2.6 生根壯苗培養(yǎng) 當(dāng)幼苗高在3～4 cm 時(shí)便可轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中，以MS 為基本培養(yǎng)基，添加NAA1.0 mg/L，添加活性炭和不添加活性炭對(duì)比試驗(yàn)，觀察生根壯苗后幼苗的葉片數(shù)量、葉片長(zhǎng)度、根數(shù)及根長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理和計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)藤苦參種子萌發(fā)的影響

將藤苦參種子播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，20 d統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率，觀察種子萌發(fā)情況。從表1 可以看出，當(dāng)不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，種子萌發(fā)率偏低，隨著6-BA 濃度的升高，種子萌發(fā)率逐漸增加。當(dāng)NAA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)，種子萌發(fā)率相對(duì)較高；當(dāng)NAA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)，種子萌發(fā)率相對(duì)較低；當(dāng)6-BA 濃度分別為1.0 mg/L 和1.5 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L 時(shí)，種子萌發(fā)率均為100%，芽生長(zhǎng)較壯。因此，最適合藤苦參種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1 g/L 活性炭或MS+1.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1 g/L 活性炭。藤苦參種子萌發(fā)生長(zhǎng)情況如圖1 所示。

表1 MS 培養(yǎng)基中不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)藤苦參種子萌發(fā)的影響

圖1 藤苦參種子萌發(fā)情況

2.2 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)藤苦參芽誘導(dǎo)的影響

將藤苦參芽接種于叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，40 d統(tǒng)計(jì)芽的增殖數(shù)。從表2 可以看出，當(dāng)6-BA 濃度在0～3.0 mg/L 時(shí)，隨著濃度的升高，芽的增殖數(shù)量增多，且芽的長(zhǎng)勢(shì)較好；當(dāng)6-BA 濃度達(dá)4.0 mg/L 時(shí)，分化的芽數(shù)開始下降；其中11 號(hào)培養(yǎng)基芽的分化數(shù)量最多。相同6-BA 濃度的情況下，NAA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)，分化的芽數(shù)相對(duì)較多。因此，最適合藤苦參叢生芽分化的培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA。藤苦參叢生芽分化具體生長(zhǎng)情況見圖2。

表2 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)藤苦參芽誘導(dǎo)的影響

圖2 藤苦參叢生芽分化情況

2.3 活性炭對(duì)藤苦參生根壯苗的影響

將每天光照時(shí)間增加至14 h，植株生長(zhǎng)旺盛，莖粗葉綠。生根培養(yǎng)50 d 后可長(zhǎng)出2～4 條根，幼苗高為6～8 cm。由表3 和圖3 可知，添加活性炭的生根培養(yǎng)基中幼苗生長(zhǎng)較壯，因此，最適合藤苦參生根壯苗的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1 g/L 活性炭。

圖3 藤苦參生根壯苗情況

表3 活性炭對(duì)藤苦參生根壯苗的影響

3 小結(jié)與討論

藤苦參為蘿藦科植物，已有同科其他植物組織培養(yǎng)研究的報(bào)道［4-9］，但未見藤苦參組織培養(yǎng)的報(bào)道。同科其他植物的組織培養(yǎng)外植體選用的是種子、莖尖、子葉、葉片等，藤苦參莖及葉均具有乳汁，且密被絨毛，在選擇外植體的時(shí)候考慮到外植體取莖尖不易滅菌，且其本身受傷會(huì)釋放乳汁影響外植體接種到培養(yǎng)基后的存活率等，所以，本研究選取種子作為外植體，可提高滅菌率，從而提高存活率。

藤苦參種子萌發(fā)培養(yǎng)中，當(dāng)6-BA 濃度分別為1.0 mg/L 和1.5 mg/L，NAA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)，種子萌發(fā)率為100%，芽生長(zhǎng)均較壯，因此，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，考慮到成本的因素，采用1.0 mg/L濃度的6-BA更合適。

在組織培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生長(zhǎng)素的合理搭配是達(dá)到最佳培養(yǎng)效果的關(guān)鍵，本研究中藤苦參叢生芽分化增殖培養(yǎng)采用了較高濃度的6-BA 和較低濃度的NAA 配合使用，這與高山林等［3］對(duì)藤苦參同科植物的組織培養(yǎng)研究結(jié)果相符。

培養(yǎng)基中添加活性炭在植物組織培養(yǎng)中較常見，在植物生根培養(yǎng)過(guò)程中，適當(dāng)增加光照時(shí)間有利于幼苗生根，但強(qiáng)光直接照射根部會(huì)抑制根的生長(zhǎng)，所以在生根壯苗培養(yǎng)基中添加活性炭可提供生根的暗環(huán)境，防止褐變；活性炭還可以吸附植物生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的一些有害物質(zhì)，因此，本研究中在生根壯苗培養(yǎng)階段添加活性炭，幼苗生長(zhǎng)較壯。