田燕歌 劉學(xué)芳 陳鍇 苗玉芳 趙高遠(yuǎn)

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；2河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3中醫(yī)藥科學(xué)院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種可預(yù)防和治療的疾病，以氣道和肺泡異常導(dǎo)致的持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征〔1〕。COPD發(fā)病率、致殘率均高，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，使其成為世界范圍內(nèi)重大課題，針對(duì)發(fā)病機(jī)制、藥物作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究占據(jù)目前COPD研究的重要地位，以大鼠為代表的動(dòng)物模型也得到廣泛應(yīng)用〔2〕。肺組織病理是判定COPD最直觀的指標(biāo)，故動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中將其作為造模成功的標(biāo)志及判定藥物療效的標(biāo)準(zhǔn)。目前研究中肺組織病理的評(píng)價(jià)方法各不相同，有描述法、定量分析法、評(píng)分法等，本文將其進(jìn)行總結(jié)，為COPD的基礎(chǔ)研究提供病理分析方面的借鑒。

1 肺組織病理的染色方法

肺組織由肺實(shí)質(zhì)和肺間質(zhì)組成，肺實(shí)質(zhì)包括導(dǎo)氣部和呼吸部，導(dǎo)氣部由肺內(nèi)的支氣管、小支氣管、細(xì)支氣管和終末細(xì)支氣管組成；呼吸部由呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡組成，兩者共同承擔(dān)肺的通氣功能；肺間質(zhì)是肺泡之間的結(jié)締組織及其內(nèi)包含的神經(jīng)、血管和淋巴管等。COPD肺組織病理改變主要涉及肺泡結(jié)構(gòu)、支氣管結(jié)構(gòu)及肺間質(zhì)改變，目前常用的染色方法主要有蘇木素-伊紅(HE)染色法、Masson染色、阿辛藍(lán)過碘酸-雪夫(AB-PAS)染色等。HE染色為常規(guī)染色方法，能較好地顯示組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，且切片可長期保存。其原理為蘇木素是堿性染料，可將細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，伊紅是酸性染料，可使多數(shù)細(xì)胞質(zhì)、肌纖維染成紅色，由此可較為清晰看到肺泡、支氣管、肺血管及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)。Masson染色即膠原纖維染色法，主要用于區(qū)分膠原纖維和肌纖維，其染色原理為小分子量易穿透結(jié)構(gòu)致密、滲透性低的肌組織，而大分子量的淡綠或苯胺藍(lán)則只能進(jìn)入結(jié)構(gòu)疏松的、滲透性高的膠原組織，故可將肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色或藍(lán)色，可直觀觀察到膠原沉積情況。AB-PAS染色主要染色糖原和多糖，可用于評(píng)價(jià)氣道黏液分泌程度，其原理為胞質(zhì)內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)(如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白等)中乙二醇基(CHOH-CHOH)經(jīng)過碘酸氧化，轉(zhuǎn)變成二醛基(CHO-CHO)，與雪夫試劑中無色品紅結(jié)合，形成紫紅色染料而沉積于細(xì)胞內(nèi)多糖處。

2 COPD肺組織病理的評(píng)價(jià)方法

肺組織病理能反映肺泡、小氣道結(jié)構(gòu)及肺間質(zhì)的變化，評(píng)價(jià)方法包括形態(tài)的描述及對(duì)氣道、肺泡的定量分析，定量分析可補(bǔ)充形態(tài)描述的不足，更為清晰準(zhǔn)確地反映肺組織病理變化。

2.1肺組織形態(tài)描述法〔3～5〕

2.1.1對(duì)肺泡的描述 肺泡的描述主要涉及肺泡大小是否均勻、結(jié)構(gòu)是否完整、有無萎陷，肺泡間隔厚度、斷裂融合及水腫情況，肺泡腔內(nèi)及肺泡壁炎癥細(xì)胞浸潤情況，肺泡腔內(nèi)有無滲出液、紅細(xì)胞和含有含鐵血黃素顆粒的巨噬細(xì)胞等。

2.1.2對(duì)支氣管的描述 支氣管的描述主要涉及支氣管管壁細(xì)胞、纖毛等排列是否整齊、有無斷裂，支氣管黏膜上皮的脫落情況、上皮細(xì)胞有無腫脹，黏膜皺襞是否增多，杯狀細(xì)胞、黏膜下腺體、平滑肌、結(jié)締組織的增生情況，支氣管壁、上皮下基底膜的厚度，管壁周圍是否有淋巴濾泡的形成，管腔內(nèi)外炎癥細(xì)胞浸潤情況，腔內(nèi)分泌物情況等。

2.1.3對(duì)肺間質(zhì)的描述 對(duì)肺間質(zhì)的描述主要涉及肺血管周圍及腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤情況，血管壁厚度、充血、淤血、出血情況，血管是否擴(kuò)張；肺間質(zhì)組織成纖維細(xì)胞增生及膠原纖維增生情況、間質(zhì)內(nèi)充血、出血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤情況等。

2.2肺組織病理評(píng)分

2.2.1肺組織損傷程度 Wang等〔6〕將肺組織病理損傷分為3個(gè)級(jí)別：輕度：肺組織及各種小支氣管炎癥細(xì)胞浸潤占全視野的1/3以下，肺泡融合占全視野1/3以下；中度：肺組織及各種小支氣管炎癥細(xì)胞浸潤占全視野的2/3以下，肺泡融合占全視野2/3以下；重度：肺組織及各種小支氣管炎癥細(xì)胞浸潤占全視野的2/3以上，肺泡融合占全視野2/3以上。

2.2.2氣道炎癥評(píng)分〔7〕選取直徑≤1 100 μm(管腔最短徑/最長徑≥0.7)的膜性細(xì)支氣管，觀察以下7項(xiàng)指標(biāo)：①上皮脫落糜爛；②上皮杯狀細(xì)胞增生；③管壁中性粒細(xì)胞(PMN)浸潤；④管壁淋巴細(xì)胞浸潤，淋巴濾泡形成；⑤管壁單核-巨噬細(xì)胞浸潤；⑥管壁嗜酸粒細(xì)胞浸潤；⑦管腔滲出。對(duì)各組大鼠按上述7項(xiàng)指標(biāo)分別評(píng)分，無病變者為0分，將輕、中、重度異常分別評(píng)為1、2、3分，然后累加每一指標(biāo)得分，將累加分占該標(biāo)本內(nèi)所有被檢的細(xì)支氣管可能得到的最高分的百分?jǐn)?shù)，作為該標(biāo)本細(xì)支氣管這一指標(biāo)的病理積分，把7項(xiàng)指標(biāo)的病理積分相加，即可得到每一標(biāo)本細(xì)支氣管的病理得分。

2.2.3氣道黏液分泌評(píng)分 馬文嫻等〔8〕采用5分(0～4)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)氣道上皮細(xì)胞中PAS染色陽性細(xì)胞百分比：無杯狀細(xì)胞為0分；杯狀細(xì)胞<25%為1分；杯狀細(xì)胞25%～50%為2分；杯狀細(xì)胞51%～75%為3分；杯狀細(xì)胞>75%為4分。

2.3肺組織的定量分析

2.3.1肺泡損傷程度 肺泡結(jié)構(gòu)異常和肺氣腫是COPD的主要病理生理改變，是氣流受限的主要因素〔9〕。有研究通過肺泡直徑(μm)〔10〕和肺泡平均橫斷面積(μm2)〔11〕反映肺泡損傷程度。肺泡平均截距(MLI)、單位面積平均肺泡數(shù)(MAN)和平均肺泡面積(MAA)是反映肺泡結(jié)構(gòu)變化及肺氣腫程度的常用指標(biāo)〔12，13〕。每組取6張及以上切片，每張切片在光鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，在100/200倍鏡下避開支氣管和大、中血管截取圖片，以計(jì)算肺泡大小和密度。

MLI(μm)=L/Ns：在每張切片中間畫“十”，測(cè)量其長度(L)，計(jì)數(shù)經(jīng)過此“十”字線的肺泡隔膜數(shù)(Ns)，其反映視野內(nèi)平均肺泡的直徑。

MAN(/mm2)=Na/S：計(jì)算每個(gè)視野的肺泡數(shù)(Na)，測(cè)量每個(gè)視野的面積(S)，其反映視野內(nèi)單位面積肺泡數(shù)目。

MAA=(S-P)/Na：計(jì)算每個(gè)視野的肺泡數(shù)(Na)，測(cè)量S，再測(cè)出HE染色陽性區(qū)域(肺實(shí)質(zhì))面積(P)，其反映視野內(nèi)平均肺泡面積大小。

2.3.2氣道重塑程度 氣道重塑是以氣道炎癥引起氣道壁損傷和分子結(jié)構(gòu)發(fā)生功能性改變?yōu)樘攸c(diǎn)，氣道壁增厚、杯狀細(xì)胞增生、黏液腺肥大等導(dǎo)致的不可逆性氣道阻塞是COPD的主要特征〔14〕。肺內(nèi)支氣管分級(jí)較多，定量時(shí)需選取同等級(jí)別支氣管，需限定支氣管直徑或周長。支氣管壁厚度(BWT)是反映氣道重塑的主要指標(biāo)，Sun等〔15〕選取周長<100 μm的支氣管，測(cè)量BWT及支氣管直徑(D)，計(jì)算BWT/D，發(fā)現(xiàn)CSE暴露16 w的大鼠BWT/D顯著增高。Xu等〔16〕每張隨機(jī)選取3個(gè)直徑為200 μm的支氣管，用醫(yī)學(xué)圖像定量分析(MIQAS)軟件進(jìn)行測(cè)量，支氣管平滑肌面積(WAsm)=平滑肌層外側(cè)面積(Asmo)-平滑肌層內(nèi)側(cè)面積(Asmi)，用管壁周長(Pi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，單位長度平滑肌層面積(WAsm/Pi，μm2/μm)表示平滑肌層厚度。王紅崗等〔17〕采用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件測(cè)量各組大鼠細(xì)BWT(μm)、管壁面積(WA，μm2)、WA/腔周長(μm2/μm)。譚玉萍等〔18〕選取膜性細(xì)支氣管(直徑750～1 100 μm)，測(cè)量各組大鼠管壁厚度(WT)、管壁平滑肌厚度并計(jì)算比值，測(cè)量WA、管腔面積(LA)并計(jì)算比值以反映氣道重塑程度。

2.3.3血管重構(gòu)程度 肺血管重構(gòu)是COPD的主要病理特征，是誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓的根源〔19〕。何飛等〔20〕研究藥物對(duì)COPD大鼠肺血管重構(gòu)的影響，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變，利用病理圖文分析系統(tǒng)采集圖像，測(cè)量與終末細(xì)支氣管伴行的肺小動(dòng)脈WT、血管直徑(VD)、LA、血管總面積(TA)、WA，然后計(jì)算WT占血管外徑百分比(WT%)、WA占血管總面積百分比(WA%)、LA占TA百分比(LA%)，以此作為大鼠的肺血管形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)對(duì)血管重構(gòu)程度進(jìn)行分析。楊宏寬等〔21〕200倍視野下測(cè)量細(xì)支氣管伴行的小動(dòng)脈的腔面積和總面積及周長，以WT%和WA%評(píng)價(jià)肺血管重構(gòu)程度。譚玉萍等〔18〕選取腺泡內(nèi)肺動(dòng)脈(直徑<400 μm)，測(cè)量血管平滑肌厚度、血管壁厚度并計(jì)算比值，測(cè)量血管壁面積、血管面積并計(jì)算比值，檢測(cè)血管平滑肌增殖情況評(píng)價(jià)肺血管重塑。Xing等〔22〕選擇外徑在100～200 μm范圍內(nèi)的小肺動(dòng)脈進(jìn)行定量分析。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，對(duì)每個(gè)樣本5條動(dòng)脈的WA和TA進(jìn)行測(cè)量和記錄，WA%來評(píng)估血管重構(gòu)。Zeng等〔23〕選取僅限于肺泡管附近的小動(dòng)脈(直徑≤50 μm)，測(cè)量肺WT，以外徑的百分比表示〔(外徑-內(nèi)徑)/外徑×100%〕，至少測(cè)量10條血管以獲得每只動(dòng)物的平均值。

2.3.4膠原沉積程度 楊宏寬等〔21〕同時(shí)也評(píng)價(jià)了支氣管膠原沉積的程度。Masson染色肺組織切片，在100倍光鏡下測(cè)量氣道壁膠原面積(WAc)和氣道基底膜周長(Pbm)，膠原沉積的程度用小氣道基底膜單位長度的膠原面積(WAc/Pbm)評(píng)價(jià)。李小龍等〔24〕每張切片選取 3 個(gè)視野，采用 Image-ProPlus 測(cè)量膠原面積、整個(gè)圖像總面積，計(jì)算膠原面積比(%)=(膠原面積/整個(gè)圖像總面積)×100%，以此評(píng)價(jià)肺組織膠原沉積的程度。

2.3.5黏液分泌程度 白學(xué)敏等〔25〕進(jìn)行AB-PAS 染色后采用IPP 軟件計(jì)數(shù)每個(gè)切片上的陽性杯狀細(xì)胞和總上皮細(xì)胞數(shù)，以陽性杯狀細(xì)胞/總上皮細(xì)胞數(shù)比例作為最終參考數(shù)據(jù)。Feng等〔26〕采用IPP6.0軟件計(jì)算AB/PAS陽性染色面積與相關(guān)支氣管上皮總面積的比率以評(píng)價(jià)支氣管上皮細(xì)胞杯狀細(xì)胞化生程度。

綜上所述，COPD病理評(píng)價(jià)方法主要有描述法、評(píng)分法、定量法，3種方法各有優(yōu)勢(shì)，可綜合應(yīng)用，其中定量法更為客觀準(zhǔn)確，主要針對(duì)肺泡、支氣管及小血管形態(tài)等進(jìn)行定量分析，雖然定量分析方法已有較多參考，但實(shí)驗(yàn)過程中仍需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)選取合適的分析方法或者進(jìn)行改進(jìn)。例如，在支氣管測(cè)量時(shí)，有些切片難以找到規(guī)定范圍的支氣管，就需要根據(jù)實(shí)際情況再設(shè)定范圍，課題組在實(shí)驗(yàn)〔27〕過程中發(fā)現(xiàn)支氣管或小血管WT并不均勻，就選取了3個(gè)位置(最長、最短、中間)進(jìn)行內(nèi)外徑的測(cè)量，最后求其平均值，也是在現(xiàn)有報(bào)道上的改進(jìn)。本文根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合前期研究經(jīng)驗(yàn)，對(duì)COPD肺組織病理分析的應(yīng)用進(jìn)行了舉例，并且發(fā)現(xiàn)這些分析方法能夠較好反映COPD肺泡、支氣管及小血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的病理變化。COPD肺組織病理分析方法的應(yīng)用或進(jìn)一步改進(jìn)可為COPD的基礎(chǔ)研究及藥物療效機(jī)制的研究提供較為直觀的依據(jù)，但仍需探索和改進(jìn)。