努爾孜亞·亞力買買提,郝敬喆,賈文捷,陳浩宇,羅 影,賈培松

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆特有大型野生食用菌巴爾喀什蘑菇,其成熟子實體埋藏在地面下30～50 cm土層內(nèi)[1]。焉耆縣博斯騰湖區(qū)的蘆葦灘由于特定的生態(tài)環(huán)境,適宜該菇的生存,該菇子實體生長在紅柳和蘆葦根部腐質(zhì)層中,5月和10月為子實體形成期,成熟的子實體個體形態(tài)差異較大。目前該野生菇未能實現(xiàn)人工栽培繁育。真菌漆酶是一種含銅離子的多酚氧化酶,能降解木質(zhì)素,去除許多酚類物質(zhì)的毒性,研究巴爾喀什蘑菇子實體的生物學(xué)特性、漆酶理化性質(zhì)及對酚類化合物的降解能力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】食用菌分類上通常采用形態(tài)學(xué)與ITS區(qū)序列測定等方法鑒定種屬關(guān)系[2]。巴爾喀什蘑菇以蘆葦、紅柳等植物纖維素和木質(zhì)素為菌體生長發(fā)育提供小分子營養(yǎng)物質(zhì)和能源[3],而木質(zhì)素降解依賴真菌漆酶反應(yīng)活性高低,酶的催化活性強弱在一定程度上決定真菌菌絲對培養(yǎng)料的生物轉(zhuǎn)化率[4]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,廣泛存在于自然界的多種植物和菌類的分泌物中,催化酚類或芳胺類等多種底物[5]。漆酶反應(yīng)活性常受溫度、pH值和金屬離子濃度變化產(chǎn)生促進或抑制作用[6]?！颈狙芯壳腥朦c】巴爾喀什蘑菇栽培馴化過程中,漆酶活性高低是提高產(chǎn)量的重要環(huán)節(jié),需研究巴爾喀什蘑菇漆酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和自身的理化特性,挖掘該漆酶對木質(zhì)素等物質(zhì)分解效率?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以采集的博湖縣黑蘑菇通過ITS區(qū)PCR擴增比對,結(jié)合子實體形態(tài)鑒定為巴爾喀什蘑菇。抽提該蘑菇子實體漆酶為研究對象,對其進行分離純化,得到漆酶分子大小、N端結(jié)構(gòu),并對其催化底物、要求的溫度、pH值、金屬離子促進抑制率等理化性質(zhì)進行研究,得到該酶活性范圍和最大利用率。

1 材料與方法

1.1 材 料

采自新疆博湖縣博斯騰湖周邊野生蘑菇巴爾喀什菇子實體。

1.2 方 法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

將采集的野生蘑菇子實體表面消毒,取髓部組織置于新鮮PDA試管斜面培養(yǎng)基中央,置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d;從純化好的PDA斜面培養(yǎng)基上,再次用滅菌的接種針鉤取前端菌絲移入新鮮PDA斜面培養(yǎng)基中間,置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌絲長滿斜面后放在4℃冰箱保存。

1.2.2 菌種鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定參照菌物學(xué)分類文獻的方法[7];(2)ITS鑒定:依據(jù)DNA提取試劑盒的方法提取真菌子實體基因組DNA。通用引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4:TCCTCCGCTTATTGGATATGC。PCR 擴增條件:94℃,預(yù)變性5 min;94℃,變性30 s,50℃,退火45 s,72℃延伸,100 s,循環(huán)30 次;72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠140 V,電泳1 h,按膠回收試劑盒說明書回收PCR 產(chǎn)物。將膠回收產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序,將獲得的堿基序列提交GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫,采用在線軟件BLAST 進行堿基序列比對分析,利用MEGA 5.0 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.2.3 子實體漆酶抽提

取50 g新鮮子實體500 mL 10%NaCl去離子水溶液4℃勻漿液過夜,浸提12 h,8 000 r/min離心10 min,取上清液即為粗酶液,4℃冰箱保存。測酶活力。

1.2.4 漆酶活性的測定

將10 μL漆酶樣品和190 μL底物ABTS溶液混合均勻,置于30℃水浴5 min反應(yīng),迅速加入300μL 3.8%HClO4終止反應(yīng),8 000 r/min離心5 min后取上清于420 nm測定吸光度,對照組用10 μL去離子水代替漆酶樣品。每個測定條件設(shè)3個平行,數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。酶活定義:在30℃下,以每分鐘氧化1 μmol 的ABTS 所需要的酶量定義為1 個酶活力單位,酶活性以U/mL 表示。參照文獻的方法[8],計算公式如下:

1.2.5 漆酶的純化

依照1.2.3方法提取上清液。上清液首先經(jīng)2.5 cm × 20 cm的CM-cellulose陽離子交換柱分離純化,該柱預(yù)先使用10 mmol/L NaAc-HAc緩沖液 (pH 4.5) 平衡,用同樣的NaAc-HAc緩沖液和分別含0.2、0.5及1.0 mmol/L NaCl的NaAc-HAc的緩沖液洗脫,收集漆酶活性組分,再使用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液 (pH 7.2) 平衡過的陰離子交換柱Q-Sepharose (1 cm × 10 cm) 進一步分離, 分別使用緩沖液和0～1 mmol/L NaCl梯度洗脫后, 得到活性組分, 透析后用Superdex 75 HR 10/30凝膠過濾層析柱經(jīng)快速蛋白液相系統(tǒng)AKTA Purifier (GE Healthcare) 進行分子篩分離 (0.2 mmol/L NH4HCO3, pH 8.5),凍干活性組分。送上海生工生物技術(shù)公司進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定。

1.2.6 漆酶酶學(xué)性質(zhì)

最適反應(yīng)溫度:漆酶酶促反應(yīng)的時間均定為10 min。根據(jù)酶活測定方法,分別測定4、10、20、30、40、50、60、70、80和90℃,10 個不同溫度下,酶促反應(yīng)10 min 后的酶活,以等體積的蒸餾水代替酶液為空白對照,將各溫度下測得漆酶的酶活,以最高酶活力計為100%, 計算相對酶活力;

最佳pH :配制不同pH 值(4～10)的緩沖液,在30℃溫度下測定不同pH 值對酶活力的影響,以等體積的蒸餾水代替酶液為空白對照,反應(yīng)10 min 后用300 μL 5%TCA終止反應(yīng),測定酶活;

金屬離子對酶活的影響:配制終濃度為5、2.5和1.25 mmol/L 的不同金同的金屬離子(K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+),取10 μL 金屬離子溶液加入到190 μL ABTS緩沖溶液中測定其漆酶活力,以添加等量去離子水為對照組。定義對照組酶活為100%,計算各金屬離子影響下漆酶的相對酶活,用相對酶活表示金屬離子對酶活的影響。

底物多樣性對漆酶的催化特性影響:配制咖啡酸、沒食子酸、甲苯胺、聯(lián)苯胺、鄰苯二酚、2,6二甲氧基酚、愈創(chuàng)木酚、對苯二酚和ABTS等終濃度為5 mmol/L的不同底物濃度溶液,取10 μL漆酶樣品加入到190 μL底物緩沖溶液中混合均勻,25℃水浴反應(yīng)10 min,用300 μL 5% TCA終止反應(yīng),分別測定各底物在最大吸收波長下的吸光值,每組做3個重復(fù)。以添加等量去離子水為對照組。定義活性最高組酶活為100%,計算各反應(yīng)底物影響下漆酶的相對酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Statistic 20.0(www.ibm.com/software/analytics/spss)對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差檢驗(One - way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生蘑菇(巴爾喀什)子實體形態(tài)學(xué)鑒定

研究表明,子實體個體較大,多為單生或散生。菌蓋半球形,直徑8～20(40)cm,后平展,中央平或稍凹陷,具有纖維質(zhì)尖端翹起的鱗片,淡褐黃色;菌肉結(jié)實質(zhì)密,厚度3～6 cm,刨開創(chuàng)面初為淡紅色,逐漸變?yōu)榧t色-紫紅色-褐色-黑色,離生或彎生;菌褶密,不等長;菌柄長7～25(47) cm,粗3～6(9) cm,中生,近圓柱形,基部膨大彎曲;菌環(huán)雙層,上層在菌柄上部,寬大,淡褐色,下層菌環(huán)窄小。孢子印黑褐色,擔(dān)子棍棒形,著生擔(dān)孢子2～4個。圖1

注:a.巴爾喀什菇湖畔生境;b.地下30 cm處子實體;c.子實體形狀;d.孢子印;e.單孢子和孢子梗(10×40X);f.菌絲形態(tài)

2.2 野生巴爾喀什菇TS基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

研究表明,將DNA 進行膠回收,并送生物技術(shù)公司測序,得到BHBC ITS基因的PCR 擴增產(chǎn)物片段長度為697 bp。將ITS基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對,BHBC與A.balchaschensis(HQ446468)的基因序列自然聚類。選出9株與BHBC ITS基因序列同源性達99%的基因序列。BHBC 與A.sinodeliciosus(KM657914.1),A.subperonatus(KX505304.1),A.desjardinii(KM657906.1)聚為一簇,相似性也最高,為99.5%,BHBC與A.balchaschensis的親緣關(guān)系最近。圖2

圖 2 BHBC 基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳檢測(左)基于ITS基因序列相似性的菌株的系統(tǒng)進化樹(右)

2.3 野生巴爾喀什菇子實體漆酶純化

研究表明,得到巴爾喀什蘑菇子實體活性組分SU1。得到電泳純的漆酶,酶的比活力由粗提物的0.048 U/mg 提高到17.02 U/mg,純化倍數(shù)為354.58。表1

表1 野生巴爾喀什菇漆酶純化變化Table 1 Results of laccase purification from A. balchaschensismushroom

2.4 野生巴爾喀什菇漆酶N-端氨基酸序列的分子量

研究表明,純化的漆酶在Superdex 75分子篩過濾。計算其分子量為65 kDa,漆酶N端的氨基酸序列為SGGPEQNTTA,與以前分離的蘑菇漆酶部分氨基酸殘基有明顯的相似性。與Pleurotusostreatuslaccase和Phlebiaradiatalaccase包涵SXGP同源序列,與BasidiomycetePM1laccase、CeriporiopsissubvermisporalaccaseI、Lepistanudalaccase、Pycnoporuscinnabariuslaccase、Russulavirescens、TrametesversicolorlaccaseI、TrametesversicolorlaccaseII、TrametesversicolorlaccaseIII和Tricholomamongolicumlaccase等包涵XXGP同源序列。表2

2.5 野生巴爾喀什漆酶理化性質(zhì)

研究表明,該菌株的最適溫度為40℃,當(dāng)溫度為4℃時,仍有活性。在4～50℃,隨著溫度升高,酶活力增加,在50℃時,酶活力達到最大值,達到51.65 U/mL,當(dāng)溫度超過50℃,酶活開始急劇下降,BHBC子實體漆酶屬于中低溫酶。圖3

漆酶活力隨著pH 值的升高而降低,pH 2.2超后,酶活力下降,pH 4.5有小波動,子實體漆酶的最適反應(yīng)pH 值為2.2,屬于酸性漆酶。在pH 2～9 均有活性。圖4

表2 野生巴爾喀什蘑菇漆酶蛋白質(zhì) 譜與其他已報道的漆酶相似性比對Table 2 N-terminal sequence comparison ofAgaricus balchaschensis laccase and other mushroom laccases

圖3 不同溫度下巴爾喀什蘑菇漆酶活性變化

圖4 不同pH下巴爾喀什蘑菇漆酶活性變化

除Cu2+對漆酶活性的有促進作用外,幾乎所有的金屬離子對漆酶活性均有抑制作用,伴隨溶液中離子濃度的降低抑制力逐漸減弱,中低濃度變化相對不大。Cu2+對漆酶活性的5 mmol/L濃度時的相對酶活為105.35%,相對Hg2+離子的抑制作用最大,高濃度5 mmol/L的相對酶活為6.94%,低濃度1.25 mmol/L的抑制率是12.21%; 5 mmol/L時的相對酶活是91.35 %;Mg2+、Mn2+、Pb2+和Cu2+離子在低濃度時的抑制作用比中濃度略有增加。表3

蘑菇漆酶對不同底物的降解活性有較大的差異。對ABTS的降解活性最高,甲苯胺和對苯二酚活性較高分別是15.77%和34%,對咖啡酸、沒食子酸、鄰苯二酚、2,6二甲氧基酚和愈創(chuàng)木酚活力較低。表4

表3 不同金屬離子下漆酶活性變化Table 3 Effect of metal ions rate of laccase from A. balchaschensis (%)

3 討 論

采自焉耆縣野生蘑菇巴爾喀什菇子實體的菌環(huán)呈兩層、雙環(huán)結(jié)構(gòu),明顯區(qū)別于雙胞菇和大肥菇,菌蓋初期卵球形,后變平展,污白色,表面光滑或有鱗片;菌髓白色受傷遇空氣變紅色;菌褶初期白色后變成紅褐色,菌肉厚與黑傘屬菌的特征高度符合[9],與文獻中描述巴爾喀什蘑菇的特征一致[8]?；驕y序分析發(fā)現(xiàn),野生蘑菇 (巴爾喀什)的ITS區(qū)序列與美味蘑菇(A.sinodeliciosusKM657914.1)、赭鱗蘑菇(A.subperonatus(KX505304.1)、A.desjardinii(KM657906.1) 菌株的同源序列覆蓋率為99.5% 。野生蘑菇BHBC基因與A.balchaschensis的同源覆蓋率達99.9%,系統(tǒng)發(fā)育樹在同一節(jié)點,親緣關(guān)系最近[10]。結(jié)合形態(tài)特征,該菌株BHBC為巴爾喀什蘑菇[8]。

野生巴爾喀什菇純化后子實體漆酶為65kD單亞基蛋白,真菌漆酶的分子量一般在50～90 kD之間,符合擔(dān)子菌漆酶[11]。 擔(dān)子菌漆酶的N 端氨基酸序列具有很大的相似性[12],采自焉耆縣野生巴爾喀什菇漆酶的N端氨基酸序列包括Ser、Gly 和Phe等氨基酸,與BasidiomycetePM1laccase、Pleurotusostreatuslaccase和Phlebiaradiatalaccase均包含SxGP序列相似度高[13]。

通常真菌漆酶的最適酶活反應(yīng)pH 范圍為3.5～6,最適作用溫度為30～50℃,過高或過低的溫度都會抑制漆酶活性[14]。研究得到的巴爾喀什蘑菇子實體漆酶pH值是2.2,最適溫度40℃。較研究報道的大多數(shù)漆酶pH低,如云芝栓孔菌(Trametesversicolor)所產(chǎn)漆酶的最適 pH為3.8[15],多孔菌(Polyporus)為4.2[16],硬毛粗蓋孔菌(Funaliatrogii)為6.0[17]。該漆酶屬酸性活性漆酶,酸性環(huán)境適應(yīng)性高于一般漆酶。金屬離子耐受實驗表明,所有種金屬離子對該酶具有抑制作用,Cu2+對漆酶活性的有微弱的促進作用,與大多數(shù)漆酶研究結(jié)論相同,證明銅離子是漆酶活動中心。Zhuo 等[18]研究了幾種金屬離子對 P. ostreatus HAUCC 162 漆酶活性有所增加,其中Cu2+效果最為顯著。 Hg2+抑制蘑菇漆酶作用最強,在濃度為5 mmol/L時酶活僅存6.94%,漆酶活性。鐵離子、銀離子及汞離子通常抑制漆酶的活性[19]。

蘑菇漆酶可以催化多種底物,代謝底物中對ABTS的催化作用最強,其次對苯二氧基酚和甲苯胺等苯環(huán)類物質(zhì)。漆酶介導(dǎo)生物體內(nèi)酚類物質(zhì)氧化偶聯(lián)合成降解木質(zhì)素和黃酮類物質(zhì)參與物質(zhì)交換[20]。

4 結(jié) 論

4.1焉耆縣采集的黑蘑菇是蘑菇屬的巴爾喀什蘑菇,是一種大型野生食用菌。子實體漆酶通過硫酸銨沉淀、纖維素CM-cellulose陽離子、Q-Sepharose陰離子交換吸附純化和Superdex 75凝膠過濾層析,得到純化倍數(shù)為354.58倍,回收率是1.5%,分子量為65 kDa的單亞基蛋白。該漆酶N端的10個氨基酸序列為: SGGPEQNTTA,與糙皮側(cè)耳和雜色云芝漆酶有相似中心。

4.2巴爾喀什蘑菇子實體漆酶具有較低的pH, 達2.2,最適溫度為40℃,屬于中低溫性漆酶。金屬離子Cu2 +對該漆酶對ABTS有輕微促進作用,Hg2 +對它有很強的抑制作用。該漆酶可以催化氧化多種底物,由強到弱主要有ABTS>二甲氧基酚>甲苯胺。