金肖葉,葉 鋒,劉麗婭,馬曉菁,李 鑫,舒 展,陳 卓,鐘 旗

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000;3.新疆阿勒泰地區(qū)動物疾控中心,新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意義】布魯氏菌病(Brucellosis),是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的一種以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人畜共患傳染病[1-3],其為多種動物共患的二類動物疫病[4-5]。新疆是我國四大牧區(qū)之一[6-7]。通過流產(chǎn)羊群所在場圈舍布局、周邊環(huán)境、畜間分布等信息進(jìn)行追溯與追蹤,對分析布病發(fā)病原因及傳染源有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】布病常用的診斷方法有兩類,一類是病原分離鑒定或聚合酶鏈反應(yīng)試驗(Polymerase Chain Reaction,PCR)等分子生物學(xué)方法[8],另一類是血清學(xué)診斷方法。Bricker等[9]開發(fā)的具有高靈敏度和特異性的聚合酶鏈反應(yīng)是最早用于布病檢測的PCR方法。布病血清學(xué)檢測方法種類較多,因其操作簡單、快速、特異性高常用于臨床樣品檢測,主要有虎紅平板凝集試驗(Tiger red plate agglutination test,RBT)[10]、膠體金試紙條(Gold immunochromatographic assay,GICA)[11]、試管凝集試驗(Standard tube agglutination test,SAT)[12]、微量凝集檢測方法(Micro agglutination Test,MAT)[13]、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)[14]、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,cELISA)[15-16]和熒光偏振檢測技術(shù)(Fluorescence polarization assay,FPA)[17]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國家標(biāo)準(zhǔn)《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646-2018)規(guī)定布病的初篩方法是RBT和iELISA,確診方法是SAT、MAT、cELISA,PCR。需研究應(yīng)用RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA和PCR等8種方法,對放牧流產(chǎn)羊群進(jìn)行布病檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】依據(jù)檢測結(jié)果,分析布病8種診斷方法的適用性,從養(yǎng)殖模式、年齡和性別等因素分析布病的流行風(fēng)險因素,為放牧羊群布病的診斷防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 羊 只

2020年6月調(diào)查流產(chǎn)羊群所在場及周邊區(qū)域環(huán)境羊只養(yǎng)殖和布病監(jiān)測及流產(chǎn)羊群的飼養(yǎng)管理、免疫、羊只流動及流產(chǎn)、死胎情況。

流產(chǎn)羊群所在場羊總存欄數(shù)為670只,其中成年羊590只,斷奶羔羊80只。

采集未經(jīng)布病疫苗免疫的放牧流產(chǎn)羊群血清和抗凝血,按照置信區(qū)間可接受誤差5%的比例進(jìn)行采樣[18],其中種公羊、后備公羊、年度有流產(chǎn)史的母羊血樣必采;每只羊采集全血和抗凝血3 mL。共采集3～5周歲成年羊血50份,3月齡羔羊血40份。

1.1.2 試 劑

RBT抗原、SAT抗原、布魯氏菌國家標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與布魯氏菌國家標(biāo)準(zhǔn)陰性血清均購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司;RBT抗原、SAT抗原、MAT抗原均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;布魯氏菌病抗體快速檢測卡(簡稱膠體金檢測卡,GICA)購自韓國安捷Bionote公司;cELISA與iELISA試劑盒購自北京維德維康生物技術(shù)有限公司;FPA試劑盒購自哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司;布魯氏菌病VirB8-PCR診斷試劑盒購自新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所。

1.2 方 法

使用RBT、GICA、SAT、MAT、cELISA、iELISA、FPA和RCR方法,對所采集的樣品進(jìn)行布病檢測。表1

表1 檢測結(jié)果Table 1 Possible results of test

1.3 數(shù)據(jù)處理

研究選用敏感性、特異性、假陰性率、假陽性率、一致率和Kappa值6種分析指標(biāo)對檢測結(jié)果進(jìn)行分析[19],并用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

符合率=[(a+d)/n]×100%;敏感性=(a/e1)×100%;特異性=(d/e2)×100%;假陰性率=(c/e1)×100%;假陽性率=(b/e2)×100%;

Kappa值={[(a+d)/n]-[(e1r1+e2r2/n2]}/{1-[(e1r1+e2r2)/n2]}。

Kappa系數(shù)<0,一致性極差;Kappa系數(shù)為0～0.2,一致性微弱;Kappa系數(shù)為0.21～0.4,一致性弱;Kappa系數(shù)為0.41～0.6,一致性中度;Kappa系數(shù)為0.61～0.8,一致性高度;Kappa為0.81～1.0,一致性極強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果

2.1.1 不同診斷方法檢測羊血清陽性率

研究表明,初篩方法中iELISA檢出陽性率最高為25.56%,RBT檢出陽性率最低為8.89%。確診方法中cELISA檢出陽性率最高為24.44%,MAT檢出陽性率最低為14.44%。平均感染率為17.78%。表2

表2 不同診斷方法檢測羊血清陽性率Table 2 Results of different diagnostic methods

2.1.2 部分血清樣品布魯氏菌PCR檢測

研究表明,14份樣品PCR產(chǎn)物擴(kuò)增出720 bp條帶,可確定為布病陽性樣品。圖1

注:M.DL2000 marker;1～14.部分血清樣品

2.2 檢測結(jié)果

2.2.1 血清學(xué)初篩方法的比較

研究表明,RBT陽性數(shù)均為8份,SAT陽性數(shù)均為16份,初篩方法以RBT檢測結(jié)果為對照,確診方法以SAT檢測結(jié)果為對照。

2.2.2 血清學(xué)初篩方法的Kappa值評價

研究表明,4種血清學(xué)初篩方法RBT、GICA、FPA和iELISA,敏感性均為100%,特異性RBT與GICA的特異性(96.34%)高于與FPA、iELISA的特異性(86.59%、81.71%)。RBT與GICA的一致性極強(qiáng)(Kappa=0.824)2種方法有較高的符合率(96.67%);iELISA與RBT、GICA、FPA的一致性中等(Kappa=0.443、0.577、0.628)符合率一般(83.33%、86.66%、86.67%)。表3,表4

表3 血清學(xué)初篩方法的比較(n=90)Table 3 Comparison of primary screening methods in serology(n=90)

表4 血清學(xué)初篩方法的Kappa值評價Table 4 The Kappavalue evaluation of the preliminary screening method in serology

2.2.3 血清學(xué)確診方法的比較

研究表明,SAT與cELISA的敏感性較高(93.75%)與MAT的敏感性(56.25%)較低,SAT與MAT、cELISA的特異性(94.59%、87.84%)較好。SAT與MAT、cELISA為中度一致性(Kappa=0.549、0.602)符合率一般,均有假陽性和假陰性。表5、表6

表6 血清學(xué)確診方法的Kappa值評價Table 6 Kappavalue evaluation of serological diagnostic methods

2.2.4 血清樣本

研究表明,母畜陽性感染率(29.68%)大于公畜陽性感染率(11.54%)。成年羊陽性感染率(42%)大于羔羊陽性感染率(2.5%)。 表7,表8

表7 不同性別羊只布魯氏菌病血清學(xué) 確診方法比較Table 7 Results of serological diagnosis of brucellosis in sheep by sex

表8 不同成長階段羊只布魯氏菌病 血清學(xué)確診方法比較Table 8 Results of serological diagnosis of brucellosis in different stages of growth

3 討 論

隨著家畜飼養(yǎng)量的不斷增加,動物及其產(chǎn)品的流通頻繁,部分地區(qū)布病發(fā)病率呈持續(xù)上升勢頭[20]。家畜易感布病的重要影響和養(yǎng)殖區(qū)域、年齡、性別、飼養(yǎng)方式、畜群規(guī)模及流產(chǎn)史等有關(guān)[21],家畜年齡是布病感染的潛在影響因素[22]。研究調(diào)查發(fā)現(xiàn),成年羊的布病陽性率明顯高于羔羊(成年羊42%>斷奶羔羊2.5%),母畜陽性率高于公畜(母畜29.68%>公畜11.54%),有流產(chǎn)史的羊群患布病的風(fēng)險更高。受季節(jié)和草場限制,新疆牧區(qū)牛羊養(yǎng)殖模式多為冬季全程舍飼,夏秋際集中放牧,也是造成布病區(qū)域性傳播的主要原因。應(yīng)選擇適合當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖模式,杜絕混牧,及時淘汰高齡家畜,最大程度降低家畜的感染風(fēng)險[23]。

消除布病是一個系統(tǒng)而復(fù)雜的過程[24-25]。需加強(qiáng)檢疫、自繁自養(yǎng),引進(jìn)種畜或補(bǔ)充畜群時要嚴(yán)格檢疫[26]。

常用的布病檢測方法RBT、GICA、iELISA和FPA操作簡單[27-28],反應(yīng)時間短,可用作初篩,但試驗容易受溫度的影響;SAT、MAT和cELISA可用作確診,但SAT操作復(fù)雜、費(fèi)時,結(jié)果判斷受主觀因素影響[29];MAT操作簡便、成本低但也容易受主觀因素的影響[30];cELISA方法具有特異性高、敏感性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),但是實(shí)驗試劑昂貴、需要特定的儀器[31-32]。目前分子生物學(xué)檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于布魯氏菌的檢測,PCR方法以其快速、準(zhǔn)確、高效性已成為布病高效檢測方法之一[33-35]。在布病的日常監(jiān)測中,面對不同區(qū)域、不同畜群、不同的免疫情況,多種血清學(xué)方法套用可提高檢測結(jié)果的全面性,再結(jié)合PCR檢測技術(shù),經(jīng)過多方法確診,更能確保檢測的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

牲畜的養(yǎng)殖區(qū)域、養(yǎng)殖模式、年齡及性別都影響著羊布病的發(fā)生、發(fā)展。放牧羊群布病陽性率隨年齡增加呈上升趨勢(成年羊42%>斷奶羔羊2.5%);雌性羊布病陽性率高于雄性(雌性29.68%>雄性11.54%),有流產(chǎn)史的羊群患布病的風(fēng)險更高,成年雌性羊更易感染布魯氏菌。采用RBT、GICA、iELISA或FPA等方法進(jìn)行初篩,再用SAT、MAT或cELISA、PCR等方法進(jìn)行確診。

InvestigationofGrazingSheepBrucellosisand