娜斯拜·阿卜杜瓦哈普,高曉娟,坤杜孜阿依·阿布都沙拉木,李江偉

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/省部共建新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】C3蛋白是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心成分,在宿主天然免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。C3d分子是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[1-2],可以與B細(xì)胞表面的CR2/CD21(補(bǔ)體受體2)結(jié)合,刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)B細(xì)胞活力,降低反應(yīng)閾值,并具有免疫佐劑效應(yīng)[3-10]。新疆雙峰駝具有極強(qiáng)的抗病性能,有關(guān)駱駝抗病性能的機(jī)制、尤其是其免疫防御的機(jī)制研究甚少,一些基礎(chǔ)資料欠缺,有必要對(duì)駱駝開展有關(guān)免疫生物學(xué)等方面的基礎(chǔ)研究。研究對(duì)雙峰駝固有免疫的重要成分補(bǔ)體C3d基因的克隆,積累駱駝免疫學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù),分析其基因序列,了解其保守性,為開發(fā)基于C3d的分子免疫佐劑提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 人的C3d位于C3分子的第996-1303位氨基酸殘基,由308個(gè)氨基酸組成。在C3轉(zhuǎn)化酶的作用下,C3分子裂解成C3a和C3b。C3b受血清中I因子、H 因子和蛋白酶的作用,又可逐級(jí)水解為i3b、C3f、C3c、C3dg、C3d和C3g等片段,其中C3d由C3dg裂解而來,是補(bǔ)體C3分子被蛋白酶裂解的最小片段,始終與抗原共價(jià)結(jié)合。自從Dempesy P W 等[11]利用基因工程領(lǐng)域的方法將雞卵溶菌酶(HEL)分別與小鼠C3d分子串聯(lián)制備成融合蛋白免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)C3d分子偶聯(lián)的HEL的免疫原性比單純HEL增強(qiáng)1 000倍,其佐劑作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于完全弗氏佐劑。通過采用部分動(dòng)物的C3d基因進(jìn)行基因疫苗構(gòu)建和表達(dá)融合蛋白等多種方式,大大促進(jìn)了疫苗的免疫原性,抗體的效價(jià)和細(xì)胞免疫水平等方面的研究[12-13]。Green等[14]利用HIV-1衣殼蛋白gp120編碼基因,分別與1～3個(gè)拷貝的小鼠C3d基因融合,構(gòu)建了不同的重組質(zhì)粒免疫小鼠,檢測(cè)血清抗體的親和力,以gp120-3C3d免疫組小鼠的抗體親和力最佳;正常機(jī)體和病理狀況下的血清中C3d在活性與含量水平上有一定的區(qū)別。Brinas等[15]將C3d的部分氨基酸作為B細(xì)胞活化的分子佐劑與腫瘤抗原一起結(jié)合至球形金納米顆粒表面,制備成新型腫瘤疫苗,證明該疫苗制備平臺(tái)可作為腫瘤相關(guān)抗原的運(yùn)載系統(tǒng)使用。C3d具有可作為良好佐劑的應(yīng)用前景。【本研究切入點(diǎn)】 目前研究人員已從多種動(dòng)物中克隆得到了C3基因,包括人、鼠、牛、羊、馬、豬、兔、雞等,但對(duì)駱駝科動(dòng)物C3基因的研究還未見報(bào)道, 也未見對(duì)新疆雙峰駝C3基因的克隆。以往報(bào)道由于C3d有較大的種屬特異性,作為佐劑,不同動(dòng)物的C3d是否具有通用性還是未知。駱駝科動(dòng)物因具有獨(dú)特的重鏈抗體,是目前制備納米抗體的主要宿主[10],需研究新疆雙峰駝C3d基因的克隆和與其他動(dòng)物的同源關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 補(bǔ)體包括C3主要由肝臟細(xì)胞表達(dá),選擇駱駝肝臟作為基因克隆的起始材料,分析各物種C3d基因序列的保守性,選擇合適的引物克隆c3d基因。通過該基因的克隆和序列分析,有助于選擇合適的C3d分子佐劑從而提高駱駝免疫的效果,為進(jìn)一步研究C3d作為分子佐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

3年齡雌性新疆雙峰駝來自新疆華凌農(nóng)牧信息科技有限公司屠宰場(chǎng)。大腸桿菌菌株BL21(DE3)(全式金生物技術(shù)有限公司),原核表達(dá)載體pMD18-T(TAKARA),限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoI(TAKARA),雙酶切試劑(TAKARA),總RNA翻轉(zhuǎn)試劑盒(TAKARA),PCR擴(kuò)增試劑盒(TAKARA),回收純化試劑盒(OMEGA),小提質(zhì)粒試劑盒(OMEGA),Trizol。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI上公布的預(yù)測(cè)的駱駝C3序列(XM_010966781.1)以及與其他動(dòng)物相關(guān)序列同源性比較的基礎(chǔ),設(shè)計(jì)特異性引物(斜體部分分別為NcoI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn))。表1

表1 PCR擴(kuò)增新疆雙峰駝C3基因引物序列Table 1 The primers of C3 gene of Bactrian camel in Xinjiang were amplified by PCR

1.2.2 肝組織總RNA提取、和RT-PCR擴(kuò)增C3d駱駝基因

雙峰駝屠宰后,立刻用無菌手術(shù)剪將肝臟右葉快速取出,剪成1 cm組織塊后,包裹在錫箔紙中,投入液氮凍存?zhèn)溆?。肝臟總RNA的提取采用李世軍等[16]所描述的方法,利用TRIZOL試劑進(jìn)行提取。提取的肝臟總RNA為模板,按照TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明建立反應(yīng)體系:1.3 μL總RNA,4 μL Prime Script RT Enzayme mix,4 μL 5×Prime Script Bμffer,1 μL RT Primer mix,用去離子DEPC水補(bǔ)足至總體積10 μL, 42℃水浴30 min,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,采用C3d基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下:95℃ 預(yù)變性5 min, 94℃,30 s, 69.7℃ 30 s, 72℃ 1 min, 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán),72℃延伸 10 min, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 C3d的克隆和鑒定

將回收純化后的C3d基因和pMD18-T載體經(jīng)雙酶切處理后在16℃水浴過夜連接,將連接過后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌E.coliBL21(DE3),平板涂布并放置于37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。挑取平板上的陽(yáng)性克隆,經(jīng)過菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切篩選鑒定陽(yáng)性菌落后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 C3d基因序列

使用DNAStar和Swiss-Model軟件對(duì)新疆雙峰駝C3d基因序列的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),使用DNAMAN,ClustW軟件對(duì)雙峰駝C3d預(yù)測(cè)序列與雙峰駝C3d克隆序列、單峰駝、家兔、牛、人、鼠、羊駝、野駝、豬的C3d氨基酸序列之間進(jìn)行多重比對(duì)并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 駱駝肝臟組織總RNA純度

研究表明,2條RNA帶(28S和18S),和1條5S低分子量RNA帶。其定量結(jié)果為1.708 μg/μL, OD260/OD280值1.92,RNA的純度較高。圖1

圖1 駱駝肝臟組織總RNA

2.2 C3d 基因的RT-PCR擴(kuò)增

研究表明,擴(kuò)增雙峰駝C3d基因獲得約900 bp大小的單一特異性條帶,同預(yù)期的結(jié)果相符。圖2

注:M:10000 bp DNA marker;1:陰性對(duì)照;2:雙峰駝C3d基因PCR產(chǎn)物;

2.3 重組載體鑒定

研究表明,有3個(gè)陽(yáng)性單克隆菌落,對(duì)其質(zhì)粒進(jìn)行NcoI和XhoI雙酶切實(shí)驗(yàn),獲得有900 bp(C3d)和2700 bp(載體)左右大小的兩個(gè)條帶,同預(yù)期的結(jié)果相符。圖3

注:M:10000 bp DNA marker;1:pMD18-T-C3d單酶切產(chǎn)物; 2:pMD18-T-C3d雙酶切產(chǎn)物

2.4 基因序列

研究表明,雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組菌株送測(cè)序。重組序列總長(zhǎng)度為923 bp,與預(yù)期結(jié)果相符(斜體部分分別為NcoI和XhoI酶切位點(diǎn))。用DNAstar和Swiss-Model軟件對(duì)雙峰駝C3d基因蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得知C3d有10個(gè)α-螺旋,7個(gè)β-折疊,15個(gè)T-轉(zhuǎn)角,且具有良好的抗原性。“MHPAVFLSLPDLRCSLLLLVTWVFTPVT”為信號(hào)肽序列,第29個(gè)氨基酸(T)是被信號(hào)肽酶切割的位點(diǎn)。由于C3d沒有跨膜區(qū)域,但存在信號(hào)肽序列,被分泌至細(xì)胞外,分布在血液和組織液當(dāng)中。將擴(kuò)增獲得的新疆雙峰駝C3d和不同物種C3d蛋白利用DNAstar軟件分析蛋白氨基酸序列的理化性質(zhì),由pH7時(shí)所帶的電荷數(shù)得知,不同物種來源C3d在蛋白相互作用中活性存在顯著差異。帶電荷量越多分子活性越強(qiáng),在不同來源C3d蛋白中雙峰駝C3d具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。不同物種C3d蛋白疏水性平均值和抗原性指數(shù)分別在0.07～0.36和0.37～0.53范圍內(nèi)。

重組序列測(cè)序結(jié)果與GenBank預(yù)測(cè)序列一致。駱駝科之間C3d基因的同源性在97%以上,與牛、豬、兔的C3d基因同源性逐漸偏遠(yuǎn),分別為,88%、88%、83%和83%。圖4～7、表2～3

圖4 新疆雙峰駝C3d基因堿基序列

圖5 新疆雙峰駝C3d基因二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖6 不同物種間C3d氨基酸序列的多重比對(duì)

表2 新疆雙峰駝補(bǔ)體C3d二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 2 Analysis of secondary structure of complement C3d of Bactrian camel in Xinjiang

表3 新疆雙峰駝補(bǔ)體C3d蛋白理化性質(zhì)Table 3 Analysis of complement C3d protein of Bactrian camel in Xinjiang

圖7 不同物種C3d基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討 論

3.1C3d是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心分子,C3在其轉(zhuǎn)化酶作用下先裂解為C3a和C3b,其中C3b再裂解為C3c和C3d,相比于其它蛋白,C3d不被蛋白酶裂解但仍保持與抗原共價(jià)連接的最小片段,它能夠轉(zhuǎn)移至血清中并穩(wěn)定存在[4]。由穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),C3d作為分子佐劑在疫苗中有廣泛應(yīng)用。

3.2在駱駝體液免疫反應(yīng)中,除產(chǎn)生常規(guī)的IgG抗體外,還產(chǎn)生天然缺失輕鏈的重鏈抗體。C3d作為B細(xì)胞激活的刺激分子,是否參與重鏈抗體的產(chǎn)生值得研究。研究克隆的C3的基因?yàn)榻窈蟊磉_(dá)該蛋白和研究其在駱駝B細(xì)胞體液免疫激活中的作用提供了材料。目前,制備納米抗體主要利用駱駝來進(jìn)行免疫獲得。對(duì)駱駝的免疫過程需要mg級(jí)的抗原蛋白,這限制了一些針對(duì)體外難以表達(dá)的蛋白的納米抗體的制備。納米抗體作為一種特殊抗體,在醫(yī)學(xué)研究中備受關(guān)注[17]。通過采用與抗原融合C3d分子佐劑的方式已經(jīng)在其他動(dòng)物中證明可以極大提高免疫效價(jià),并且降低抗原的用量。駱駝C3d基因的克隆,一方面在納米抗體的利用及開發(fā)具有一定的價(jià)值,另一方面能夠?yàn)轳橊凜3d蛋白的綜合利用提供基礎(chǔ)和參考。

3.3對(duì)不同動(dòng)物體中C3d的克隆方法,完成了駱駝C3d基因的克隆研究[18]。通過生物信息學(xué)軟件對(duì)所得到的基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)序列相符,此外駱駝屬間補(bǔ)體C3d基因的親緣性較高,可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。與牛、豬等動(dòng)物補(bǔ)體C3d基因親緣性高,而與兔、人有一定的差異。鼠的C3d與駱駝的C3d的氨基酸的親緣性最低。不同物種間C3d具有一定的差異,駱駝C3d具有種屬特異性,用于異源可能會(huì)引起針對(duì)C3d的免疫應(yīng)答。

4 結(jié) 論

從駱駝肝臟組織中克隆得到了長(zhǎng)度為909個(gè)bp,編碼303個(gè)氨基酸的C3d基因,與駱駝科C3d基因之間的同源性在97%以上, 與牛和豬C3d基因同源性為88%,與兔和人的C3d基因同源性為83%。該C3d基因在進(jìn)化中具有保守性,在駱駝免疫中可以采用親緣關(guān)系較近的動(dòng)物來源的C3d作為分子佐劑從而增強(qiáng)駱駝免疫效果。