何志恒

(湖北省武漢市第十二中學(xué))

基因工程中構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)單酶切、雙酶切、PCR技術(shù)與瓊脂糖凝膠電泳是教學(xué)難點(diǎn),在習(xí)題中也常出現(xiàn)錯(cuò)誤,本文將通過瓊脂糖凝膠電泳在雙酶切產(chǎn)物分離中的作用對其進(jìn)行分析。

1.背景知識,追根溯源

在使用單酶切的載體或者平端載體時(shí),載體本身的兩個(gè)DNA末端可以匹配,產(chǎn)生自身連接的產(chǎn)物。如果載體濃度和插入DNA片段濃度均較低,則載體DNA兩個(gè)末端之間碰撞的機(jī)會大于和目的DNA末端碰撞的機(jī)會,就會導(dǎo)致載體DNA分子的自身連接,形成環(huán)化的載體分子。

在將目的基因片段插入到載體中的時(shí)候,由于酶切位點(diǎn)序列的回文特征,若使用單個(gè)限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行克隆,目的片段插入的方式將會有正向和反向兩種,并且在將目的片段與載體片段連接的時(shí)候,載體片段將會發(fā)生較高程度的自連,從而降低克隆載體構(gòu)建的成功率。

可見,導(dǎo)致目的基因環(huán)化、載體自身環(huán)化、目的基因與載體反向連接的原因是使用單酶切導(dǎo)致目的DNA和載體DNA的兩端只有一種黏性末端,或者酶切后的末端為平末端。

使用兩種限制酶切割即可避免目的基因、載體的錯(cuò)誤連接。例如圖1和2中要切割目的基因,若使用BamHⅠ和BgtⅡ這兩種限制酶,BamHⅠ和BgtⅡ都可切出序列-GATC-的黏性末端,可以互補(bǔ)配對,因此用BamHⅠ和BgtⅡ同時(shí)切割目的基因不能防止酶切后含目的基因的DNA片段自身連成環(huán)狀。因此,應(yīng)該選切出的黏性末端不同的兩種限制酶。

圖1

圖2

用兩種能切出不同黏性末端的限制酶切割質(zhì)粒后,仍然有微量質(zhì)粒只被一種限制酶切割,原因可能是反應(yīng)時(shí)間太短,若時(shí)間允許,可將PCR產(chǎn)物的限制性酶酶切時(shí)間延長到16h以上,以保證酶切完全。

用兩種能產(chǎn)生不同黏性末端的限制酶切割后的質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行連接反應(yīng),為避免產(chǎn)生目的基因、載體的錯(cuò)誤連接,要先將雙酶切后的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離,選出可用于連接反應(yīng)的DNA條帶,淘汰不能用于連接反應(yīng)的DNA條帶,再進(jìn)行連接反應(yīng),避免目的基因、載體錯(cuò)誤連接。

因此,對目的基因所在DNA、質(zhì)粒用雙酶切,再進(jìn)行連接反應(yīng),可得到正確的連接產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)化時(shí),轉(zhuǎn)化效率并不是100%,可能產(chǎn)生兩種受體細(xì)胞,一種是含重組質(zhì)粒的細(xì)胞,一種是不含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。不含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞中既不含重組質(zhì)粒,也不含質(zhì)粒,也不含環(huán)化的目的基因。

2.例題分析,修正錯(cuò)誤

用能產(chǎn)生不同黏性末端的限制酶切后得到的是很多種連接產(chǎn)物,還是一種正確的連接產(chǎn)物,在習(xí)題中多次出現(xiàn)。下面筆者以三道題為例,分析酶切后的連接產(chǎn)物。

【例題1】(2019·江蘇卷·33)圖3是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖,載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請回答下列問題:

圖3

(1)EcoR V酶切位點(diǎn)為…GAT↓ATC…

…CTA↑TAG…＇

EcoR V酶切出來的線性載體P1為________末端。

(2)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段,其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理,在兩端各添加了一個(gè)堿基為________的脫氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在________酶作用下,形成重組質(zhì)粒P3。

(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選,得到A、B、C三類菌落,其生長情況如表(“+”代表生長,“-”代表不生長)。根據(jù)表中結(jié)果判斷,應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類,另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________、________。

表1

(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒,擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖4所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置,PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段,原因是________。

圖4

【參考答案】(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA連接 (3)B A類菌落含有P0 C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 (4)乙丙 目的基因反向連接

【補(bǔ)充說明及分析】如何使目的基因兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸,質(zhì)粒的兩端各自帶有一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸?可以用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給質(zhì)粒、目的基因兩端添加一個(gè)脫氧核苷酸。反應(yīng)完成后,會有部分質(zhì)粒、目的基因沒有被添加上脫氧核苷酸。

能否分離出含有平末端(未添加成功)的質(zhì)粒、目的基因呢?利用瓊脂糖凝膠電泳能分離的DNA的長度是有限的,雙鏈DNA分子在凝膠中的遷移速率與其堿基對數(shù)目的常用對數(shù)成反比,上述兩類DNA片段只相差一個(gè)堿基對,很難用瓊脂糖凝膠電泳分離開。因此即使進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,也很難分離出平末端的質(zhì)粒、目的基因。

因此再用DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)后,就會出現(xiàn)平末端的質(zhì)粒(P1)、目的基因環(huán)化的情況,其中P1重新環(huán)化為P0。

由于目的基因的兩端是堿基為A的脫氧核苷酸,處理后質(zhì)粒的兩端是堿基為T的脫氧核苷酸,進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí),目的基因和質(zhì)粒能夠正向連接、也能反向連接。因此,轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞有四種:未轉(zhuǎn)化的、含重組質(zhì)粒(P3)的、含質(zhì)粒的(P0)、含環(huán)化目的基因的。因此,只能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長的是含重組質(zhì)粒(P3)的受體菌,能在含四環(huán)素和青霉素培養(yǎng)基上生長的是含質(zhì)粒P0的受體菌,不能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長的是未轉(zhuǎn)化的受體菌和含環(huán)化目的基因的受體菌。

通過PCR技術(shù)擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳就能區(qū)分目的基因和質(zhì)粒的正向連接產(chǎn)物、反向連接產(chǎn)物。如果是正向連接,擴(kuò)增出的片段長度最長為350 bp,如果是反向連接,擴(kuò)增出的片段長度最長為400 bp。

這道高考題很好地體現(xiàn)了PCR技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)在區(qū)分DNA連接產(chǎn)物中所起的作用,符合《課程標(biāo)準(zhǔn)》命題建議里提到的“科學(xué)性、規(guī)范性,要能夠區(qū)分出不同素養(yǎng)水平的學(xué)生”。但是題目中沒有詳細(xì)說明目的基因和載體連接時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤連接的原因:瓊脂糖凝膠電泳能分離的DNA長度是有限的,兩個(gè)DNA片段只相差一個(gè)堿基對,很難用瓊脂糖凝膠電泳分離開。這就導(dǎo)致教輔資料在模仿高考題出題時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤,如例題2。

【例題2】研究人員用圖5中質(zhì)粒和圖6中含目的基因的片段構(gòu)建重組質(zhì)粒(圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶切割位點(diǎn)),將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后進(jìn)行篩選及PCR鑒定。以下敘述不正確的是

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圖5

圖6

A.構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶

B.使用DNA連接酶將酶切后的質(zhì)粒和目的基因片段進(jìn)行重組

C.能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存一定是含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌

D.利用PCR鑒定含目的基因的大腸桿菌時(shí)應(yīng)選用引物甲和引物丙

【答案】C

【分析】本題選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識別位點(diǎn),但BamHⅠ會使質(zhì)粒中的標(biāo)記基因都被破壞,因此只能選BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割,BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶的識別序列不同,切割后產(chǎn)生的黏性末端也不同。據(jù)前文所述,在酶切反應(yīng)時(shí)間充足的條件下,切割后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收切割產(chǎn)物,由于質(zhì)粒和目的基因所在DNA被切割后產(chǎn)生的DNA片段長度有明顯差異,瓊脂糖凝膠電泳能將需要的片段篩選出來。再用DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),則連接產(chǎn)物只有質(zhì)粒和目的基因正確連接一種。該重組質(zhì)粒只有四環(huán)素抗性基因是正常的,氨芐青霉素抗性基因因插入了目的基因而失活。因此轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌有兩種類型:未轉(zhuǎn)化的、含重組質(zhì)粒的。未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有四環(huán)素抗性基因,不能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存,含重組質(zhì)粒的大腸桿菌有四環(huán)素抗性基因,能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存。從這個(gè)角度分析,C選項(xiàng)是正確的。

但此題沒有給出“酶切反應(yīng)時(shí)間充足”這個(gè)條件,高中生物學(xué)教材也沒有提到:在酶切反應(yīng)后先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物,再用DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),得到的連接產(chǎn)物就是正確的。不了解這個(gè)過程,不理解其中的原理,做這一類題往往稀里糊涂的被動接受。可將此題題干條件補(bǔ)充為“酶切反應(yīng)時(shí)間充足,并用瓊脂糖凝膠電泳分離出所需DNA片段后,再進(jìn)行連接反應(yīng)的條件下”,C選項(xiàng)修改為“能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的不一定是含重組質(zhì)粒的大腸桿菌”,C選項(xiàng)才能作為此題的答案。與此題出現(xiàn)的錯(cuò)誤類似的題有很多,例如例題3。

【例題3】運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù),將奶牛細(xì)胞中編碼凝乳酶的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌細(xì)胞中,以達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)凝乳酶的目的。圖7表示用作載體的質(zhì)粒和目的基因所在DNA片段。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?/p>

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圖7

A.用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA連接酶構(gòu)建基因的表達(dá)載體

B.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的即為導(dǎo)入目的基因的細(xì)菌

C.可用PCR技術(shù)大量擴(kuò)增目的基因

D.用Ca2+處理大腸桿菌使其易于轉(zhuǎn)化

【答案】B

【分析】據(jù)前文所述,只能用BamHⅠ、PstⅠ切割。用雙酶切法產(chǎn)生的質(zhì)粒、目的基因片段,酶切反應(yīng)時(shí)間充足的條件下,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后,分離出所需的DNA片段再用DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),得到的應(yīng)該只有質(zhì)粒和目的基因的正確連接產(chǎn)物,含有氨芐青霉素抗性基因。轉(zhuǎn)化后大腸桿菌的種類有兩種,一種是不含重組質(zhì)粒的,即只有大腸桿菌本身的DNA,一種是含重組質(zhì)粒的。因此能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長的即為導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌,B選項(xiàng)應(yīng)該是正確的。此題需要補(bǔ)充“酶切反應(yīng)時(shí)間充足,并用瓊脂糖凝膠電泳分離出所需DNA片段后,再進(jìn)行連接反應(yīng)”,此題的B選項(xiàng)可修改為“用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的不一定為導(dǎo)入目的基因的細(xì)菌”,這樣B選項(xiàng)才能作為此題的答案。