王孝蕓 唐紅梅 王星 馬寧 李月蛟 袁謝芳 徐國鋒 張沄，2

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，2呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（四川瀘州646000）

空氣污染是全球面臨的嚴(yán)峻問題。大氣顆粒物（PM）暴露可導(dǎo)致哮喘等呼吸道疾病的發(fā)生［1］。SiO2是PM 的一種，肺炎和肺纖維化與SiO2密切相關(guān)。黏液高分泌是氣道疾病的病理性特征，黏液蛋白是黏液的主要成分，MUC5AC 是氣道分泌最多的一種黏液蛋白［2-5］。SiO2可誘導(dǎo)氣道黏液過度表達(dá)［6］，但其影響氣道黏液高分泌的作用機(jī)制還鮮有報(bào)道。

自噬是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，利用溶酶體降解所包裹內(nèi)容物的過程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要作用［7］。自噬可通過調(diào)控NFKB1 和AP-1 的活性，以及促進(jìn)JNK 和c-Jun 的磷酸化等途徑參與調(diào)節(jié)PM 暴露誘導(dǎo)的黏液高分泌［8-9］，但自噬是否參與SiO2誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌鮮見報(bào)道。本研究旨在探討SiO2是否通過自噬增加人氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC 的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要材料人氣道上皮細(xì)胞株Beas-2b（ATCC）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；mCherry-EGFP-LC3慢病毒載體、ATG5-siRNA 和BECN1-siRNA 慢病毒載體（中國上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)公司）；SiO2（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；用于Western blot 的抗體：MUC5AC（Abcam）、ATG5（MBL 公司）、BECN1（MBL公司）、LC3Ⅱ（Abcam）、GAPDH（碧云天生物技術(shù)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)Beas-2b。將Beas-2b分為對(duì)照組、SiO2組、NC-siRNA 組、NC-siRNA+ SiO2組、ATG5-siRNA 組、ATG5-siRNA+ SiO2組、BECN1-siRNA 組、BECN1-siRNA+SiO2組。各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用相應(yīng)慢病毒（MOI = 20）轉(zhuǎn)染12 h 后換新鮮培養(yǎng)基，并用1 μg/mL 的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。細(xì)胞用100 μg/mL 的SiO2刺激24 h。

1.2.2 免疫熒光檢測Beas-2b 中MUC5AC 的表達(dá)將Beas-2b 細(xì)胞接種在共聚焦培養(yǎng)皿用于免疫熒光分析。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，PBS 清洗后用0.1%的TritonX-100 穿孔10 min，然后用1% BSA 室溫封閉30 min。封閉后用抗MUC5AC的一抗（1∶50）4 ℃孵育過夜。次日加入Alexa Fluor 555 結(jié)合的二抗（1∶100）室溫避光孵育1 h，然后加入DAPI 室溫避光作用5 min。所有步驟完成后將標(biāo)本置于激光共聚焦顯微鏡下觀察MUC5AC表達(dá)并進(jìn)行分析。

1.2.3 共聚焦顯微鏡觀察Beas-2b 自噬情況將Beas-2b 細(xì)胞接種在共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)，用mCherry-EGFP-LC3 慢病毒（MOI=20）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，100 μg/mL的SiO2刺激細(xì)胞24 h。24 h 后在共聚焦顯微鏡下觀察Beas-2b 自噬情況。

1.2.4 Western blot 檢測Beas-2b 中MUC5AC、ATG5、BECN1 和LC3 蛋白表達(dá)用RIPA 裂解液（已加磷酸酶抑制劑）于冰上裂解細(xì)胞5 min，在4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清液即為蛋白提取液。BCA 法測定蛋白濃度。用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白（恒壓100 V，90 min），三明治法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（恒流200 mA，3 h），5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉后分別用MUC5AC 抗體（1∶500）、LC3B 抗體（1∶1 000）、BECN1 抗體（1∶1 000）和ATG5 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日加入相應(yīng)的二抗于室溫孵育2 h。TBST 洗滌后用凝膠成像儀采集條帶圖像，并用FluorChem 8900 軟件分析目的蛋白條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用（）表示，并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 SiO2 增加Beas-2b 細(xì)胞MUC5AC表達(dá)SiO2組的MUC5AC 熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組（P＜0.01，圖1A、B）。SiO2組的MUC5AC表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05，圖1C、D）。

圖1 SiO2增加Beas-2b 中MUC5AC表達(dá)Fig.1 SiO2 increased the expression of MUC5AC in Beas-2b

2.2 SiO2 促進(jìn)Beas-2b 自噬蛋白表達(dá)SiO2組的自噬小體較對(duì)照組有明顯增加（圖2A、B）。SiO2組的ATG5、BECN1 和LC3Ⅱ的蛋白水平要高于對(duì)照組（P＜0.05，圖2C、D）。

圖2 SiO2促進(jìn)Beas-2b 自噬蛋白表達(dá)Fig.2 SiO2 promoted the expression of autophagy protein in Beas-2b

2.3 SiO2通過上調(diào)ATG5增加Beas-2b中MUC5AC表達(dá)SiO2可使Beas-2b中MUC5AC、LC3Ⅱ和ATG5的蛋白水平增加（P＜0.05），而ATG5-siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，以上蛋白的表達(dá)均減少（P＜0.05，圖3A、B）。ATG5 被敲減后，SiO2誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)降低（P＜0.05，圖3C、D）。

圖3 SiO2通過上調(diào)ATG5 增加Beas-2b 中MUC5AC表達(dá)Fig.3 SiO2 increased the expression of MUC5AC in Beas-2b by up-regulating ATG5

2.4 SiO2通過上調(diào)BECN1增加Beas-2b中MUC5AC表達(dá)BECN1 敲減的Beas-2b 被SiO2刺激后，LC3Ⅱ和MUC5AC 蛋白水平均低于陰性對(duì)照細(xì)胞（P＜0.05，圖4）。

圖4 SiO2通過上調(diào)BECN1 增加Beas-2b 中MUC5AC 的表達(dá)Fig.4 SiO2 enhanced the expression of MUC5AC in Beas-2b by up-regulating BECN1

3 討論

空氣污染，尤其是環(huán)境中的PM 對(duì)人的身體健康有許多不利影響，而肺則是被其主要影響的器官。研究表明，長期暴露于PM 污染會(huì)導(dǎo)致肺功能降低，并加重哮喘等慢性呼吸系統(tǒng)疾?。?0-12］。SiO2是大氣顆粒物的一種，容易引起嚴(yán)重的肺損傷、矽肺病或特異性肺纖維化［13-15］。

黏液高分泌是氣道疾病的重要病理特征，MUC5AC 是氣道分泌最多的一種黏液蛋白。炎性因子、空氣污染物和病原體均可導(dǎo)致MUC5AC高表達(dá)并進(jìn)一步促進(jìn)炎癥［16-17］。研究表明，SiO2可以誘導(dǎo)黏液過度表達(dá)［6］，但其調(diào)節(jié)Beas-2b 中MUC5AC表達(dá)的作用機(jī)制目前還鮮報(bào)道。本研究用100 μg/mL 的SiO2刺激Beas-2b 細(xì)胞24 h，分別用免疫熒光和Western blot 方法檢測Beas-2b 細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SiO2刺激組的MUC5AC表達(dá)明顯高于PBS 對(duì)照組，提示SiO2可以促進(jìn)Beas-2b中MUC5AC 的表達(dá)。

自噬是細(xì)胞自身的一種程序性死亡，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬在包括慢性肺阻塞性疾病、特異性肺纖維化、急性肺損傷及肺癌等呼吸道相關(guān)疾病中起著重要作用［18-20］。參與自噬過程的多種自噬相關(guān)蛋白如ATG5、BECN1和LC3 及PI3K/AKT/mTOR、AMPK 等多條信號(hào)通路均可影響炎性因子的釋放和細(xì)胞死亡等過程［21］。有研究報(bào)道，SiO2可以通過PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)途徑，誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞自噬并產(chǎn)生炎癥；SiO2導(dǎo)致的肺纖維化與單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白1（MCPIP1）/p53 信號(hào)途徑介導(dǎo)的自噬相關(guān)；研究表明SiO2還可激活肺成纖維細(xì)胞自噬［22-24］。然而SiO2是否能引起氣道上皮細(xì)胞自噬并未有研究報(bào)道。本研究中，用SiO2刺激Beas-2b，在共聚焦顯微鏡下觀察Beas-2b 中的自噬現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)SiO2組的自噬體（mCherry+EGFP+）和自噬溶酶體（mCherry+EGFP-）較對(duì)照組均有明顯增加。同時(shí)用Westernblot 實(shí)驗(yàn)檢測自噬相關(guān)蛋白ATG5、BECN1 和LC3 II 表達(dá)，結(jié)果顯示在SiO2組中此3 種蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組。表明，SiO2可促進(jìn)Beas-2b 細(xì)胞自噬。

本研究進(jìn)一步探討了SiO2通過調(diào)節(jié)Beas-2b 細(xì)胞自噬并促進(jìn)MUC5AC表達(dá)的作用機(jī)制。迄今為止，共有三十多種自噬相關(guān)基因和蛋白被證實(shí)，BECN1、ATG5 和LC3 是其中被研究最多的分子［7］。BECN1 在自噬泡的形成中起重要作用，可促進(jìn)胞吞作用和內(nèi)涵體的成熟。ATG5 可與自噬泡融合，是參與自噬泡延伸的關(guān)鍵蛋白。LC3 同樣參與自噬泡的延伸，它能夠與新形成的膜結(jié)合，直到自噬溶酶體的形成，因此LC3 常被用作自噬形成的標(biāo)志［25］。本研究分別用ATG5-siRNA 和BECN1-siRNA 轉(zhuǎn)染人氣道上皮細(xì)胞，同時(shí)用NC-siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞做陰性對(duì)照。Western blot 和免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，ATG5-siRNA+SiO2組和BECN1-siRNA+SiO2組的LC3Ⅱ水平較NC-siRNA+SiO2組有明顯降低，且MUC5AC表達(dá)較陰性對(duì)照組也有所減少。以上說明SiO2可通過上調(diào)ATG5 和BECN1 增加氣道上皮細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)MUC5AC 的表達(dá)。

綜上所述，本研究探索了SiO2通過調(diào)節(jié)人氣道上皮細(xì)胞自噬促進(jìn)MUC5AC表達(dá)的作用及機(jī)制。首次表明，SiO2可通過上調(diào)ATG5 和BECN1，增加氣道上皮細(xì)胞自噬并促進(jìn)MUC5AC 的表達(dá)，為臨床治療相關(guān)呼吸道疾病提供了新的思路。但本研究亦存在一些不足，比如只做了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)未做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以及SiO2對(duì)ATG5 和BECN1 的具體調(diào)節(jié)機(jī)制未闡明。后續(xù)將跟進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并對(duì)相關(guān)自噬調(diào)控機(jī)制做進(jìn)一步研究。

【Author contributions】ZHANG Yun：Conceived and designed the study.WANG Xiaoyun，TANG Hongmei，WANG Xing，MA Ning，LI Yuejiao，YUAN Xiefang，XU Guofeng：Performed the experiments.WANG Xiaoyun：Wrote the paper.WANG Xing，WANG Xiaoyun and ZHANG Yun：Analyzed the data.All authors read and approved the final manuscript