李小杰 譚冬 杜玉民 袁宇

河北大學附屬醫(yī)院神經外科（河北保定071000）

癲癇是一種常見的神經系統(tǒng)疾病，由于神經元網絡畸形或受到創(chuàng)傷性、感染性或代謝紊亂的影響時，大腦的局部或全腦會出現異常的同步神經元放電，就會導致癲癇發(fā)作；以反復發(fā)作和不可預知的發(fā)作為其特點［1］。腦微透析技術的產生使其可以用來測量癲癇發(fā)作前、中和后興奮性和抑制性神經化學物質濃度的變化，并與電生理數據相關聯，促進了癲癇研究的突破［2］。隨著腦微透析技術的不斷發(fā)展，包括分段流、快速液相色譜（LC）和激光誘導熒光毛細管電泳（CE-LIF）等方法的應用，使微透析的時間分辨率明顯提高到1 分鐘以上，可用于測量癲癇發(fā)作相關的瞬時自發(fā)神經化學變化。已開發(fā)出比傳統(tǒng)探針小得多的微型取樣探針，具有更大的空間分辨率，它們可以針對癲癇研究中重要的特定腦區(qū)進行監(jiān)測。將微透析取樣與光遺傳學和光刺激神經遞質的釋放相結合，也對研究癲癇發(fā)作起到了一定效果。本文就目前改進時間分辨率的腦微透析技術、微型化取樣探針、光遺傳學結合腦微透析技術作一綜述。

1 腦微透析技術概述

腦神經化學物質在各種神經過程中發(fā)揮著非常重要的作用，包括腦神經元之間的神經信號傳播、神經系統(tǒng)功能的維持以及促進神經元細胞的生長和修復［3］。因此，神經化學物質的失調可能導致多種腦部疾病，例如癲癇、帕金森病、阿爾茨海默病、腦水腫和腦缺氧等［4］。由于腦神經化學物質在神經系統(tǒng)中的重要性，腦神經化學物質檢測開始廣泛研究，以便于更好地了解腦神經傳遞和生理功能。腦微透析技術因此應運而生。腦微透析技術是一種可以對腦細胞外間質液進行采樣的有創(chuàng)性技術，它能夠連續(xù)檢測腦細胞外間質液的化學成分。腦微透析裝置由探針、導管、微量灌流泵、樣品收集器和分析儀組成；探針由流入管、流出管和中空纖維管構成，根據腦立體定位圖譜，可借助腦立體定位儀植入；腦微透析床旁分析儀可以將采樣流體（也稱為微透析液）每小時分析一次，其工作原理基于酶促反應［5］。我們可以用來檢測癲癇發(fā)生時大腦中如NF-κB 和IL-6 等蛋白含量的變化［6］，亦能夠觀察如使用左乙拉西坦和奧卡西平等抗癲癇時引起的神經化學物質改變［7-8］。然而，由于分析的數據具有滯后性，其時間分辨率不高［9］。因此，需要有效和及時地測量微透析液來預測癲癇的發(fā)生和變化。為了實現這一點，新興的研究將腦微透析技術改進，有效地提高了其時間分辨率和檢測范圍，使癲癇的研究更加精確和清晰。

2 改進時間分辨率的腦微透析技術

傳統(tǒng)的腦微透析技術上只能夠在5～10 min的間隔里對腦細胞外間質液進行采樣分析。限制時間分辨率的關鍵取決于所用分析方法的靈敏度，即必須在一定時間內收集足夠的樣品才能有足夠的材料進行分析［9］。使用能夠提高靈敏度的方法，如激光誘導熒光毛細管電泳技術（CE-LIF）和快速液相色譜技術（FLC）等，可以提供更好的時間分辨率［10］。

2.1 激光誘導熒光毛細管電泳技術激光誘導熒光毛細管電泳技術（CE-LIF）在監(jiān)測3-巰基丙酸（3-MPA）誘發(fā)癲癇的神經化學變化的研究顯示出了較高時間分辨率的潛在效用［10］。利用CE-LIF 技術可以在“快”（60 s）和“慢”（5 min）時間尺度上測量谷氨酸和GABA 的變化［10］。CRICK 等人利用CE-LIF 技術分析3-巰基丙酸（3-MPA）癲癇大鼠模型腦部快速1 分鐘微透析采樣的氨基酸/神經遞質數據，觀察到一個獨特的趨勢，谷氨酸顯示出了雙相活性。在5～25 min 內，谷氨酸明顯增加，40～65 min 再次增加。在實驗的最后30 分鐘，谷氨酸也持續(xù)增加。60 s 取樣結果表明，3-MPA 引起的谷氨酸變化呈雙峰型，而在“慢”5 min 取樣的時間尺度下這種雙峰變化并不明顯［10］。 癲癇持續(xù)狀態(tài)通過利用激光誘導熒光毛細管電泳技術（CE-LIF）的腦微透析采樣獲得了相對較高的時間分辨率的結果，這在將來可以為難以預知的癲癇發(fā)作和自發(fā)性癲癇的發(fā)作提供新的見解。

上述研究結果表明，時間分辨率的提高可以更好地揭示癲癇發(fā)作背后的化學變化。在不久的將來，隨著技術的進步，我們可以更清晰地研究導致癲癇發(fā)作的神經化學變化，甚至更高分時間辨率的神經化學變化（如每一秒的變化），借此可以揭示更多關于神經化學模式的信息。

2.2 快速液相色譜技術（FLC）由于自發(fā)性癲癇的發(fā)作是隨機的［11］，因此利用連續(xù)的高時間分辨率的方法會對監(jiān)測自發(fā)性癲癇的發(fā)作起到很大作用。最近，一些實驗小組報告了與微透析相結合的快速液相色譜技術（FLC）的發(fā)展，這種技術可以連續(xù)、在線操作對一些抗癲癇藥物進行長達1 分鐘時間甚至更長時間的連續(xù)檢測［12-13］?？焖僖合嗌V技術（FLC）對高效液相色譜的透析液流通路進行了細致地優(yōu)化并且用到了高靈敏度的電化學或光電化學檢測器，并且在透析液中加入了穩(wěn)定試劑，這種新技術已用于監(jiān)測大鼠紋狀體中甲基苯丙胺在自由活動的動物體內代謝過程中的多巴胺及血清素的變化［14］。由于時間分辨率的提高，可以更加精確研究局部甲基苯丙胺的代謝產物變化以及受藥物影響的多巴胺水平。

這種技術的一個重要特點是它們可以進行連續(xù)操作和檢測，因此有可能檢測到未預測或自發(fā)性的神經化學物質的瞬時變化。例如，利用快速液相色譜技術（FLC）連續(xù)測量自由活動小鼠腦微透析液一項研究顯示，該技術可以在7 min 內同時分析小鼠微透析液中的單胺、其前體和代謝物以及乙酰膽堿（ACh）、膽堿（Ch）和γ-氨基丁酸（GABA）等物質的變化，并能夠測定特定大腦區(qū)域的基礎神經遞質水平，從而檢測疾病相關和藥物誘導的神經化學改變［15］。同時快速液相色譜技術（FLC）也可以用來測量5-羥色胺轉運體（SERT）和性別差異介導刺激的5-羥色胺的水平［16］。因此，利用快速液相色譜技術（FLC）可以對癲癇的發(fā)作進行連續(xù)監(jiān)測，能夠捕捉到其發(fā)作相關神經化學物質的連續(xù)變化及影響這些物質水平因素的相關機制進行更進一步的研究。

2.3 微量液滴快速毛細管電泳技術（DFCE）目前微量液滴快速毛細管電泳技術（DFCE）可以使時間分辨率達到幾秒鐘以內［17］。如此高的時間分辨率有助于更好地描述導致癲癇發(fā)作的神經化學動力學。但要達到足夠高的靈敏度，則必須面對在幾秒鐘的時間間隔內收集樣本的技術挑戰(zhàn)，如果微透析灌注速率為1 μL/min，則該幾秒種間隔的收集的樣本量相當于納升的體積［18］。收集這種小樣本的一種方法是采用分段流體取樣，其中樣本與不混溶的流體穿插，以形成小樣本陣列進行分析［19-20］。

微量液滴快速毛細管電泳技術（DFCE）技術的出現顯著提高了微透析的時間分辨率。該技術通過利用一個含有不相容載體相（全氟萘烷/PFD）的微型聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上的三通通道將透析液分段成納升栓［21］。微透析液通過單個樣品栓（即納升栓）的熒光測量的時間明顯小于非樣品栓測量的時間［21］，從而達到提高時間分辨率的目的。

為了進一步推進時間分辨率的界限，電噴霧電離質譜（ESI-MS）技術與微量液滴快速毛細管電泳技術聯用，可以在5 秒的時間分辨率內對體內的乙酰膽堿進行監(jiān)測［22］。此外，將2 nL 體內的微透析液組分在納升塞中收集并利用這種聯合技術進行神經化學監(jiān)測時，時間分辨率可以達到2 s［23］。因此，微量液滴快速毛細管電泳技術將會是一種理想的方法，可以將微透析取樣的時間分辨率提高到亞分鐘的時間尺度，以測量隨機自發(fā)性癲癇發(fā)作期間的神經化學變化。

3 微型化取樣探針

為了在癲癇發(fā)作期間利用微透析進行神經化學測量，我們必須要監(jiān)測特定的大腦區(qū)域，如海馬區(qū)和核重聚體［24］。傳統(tǒng)的微透析探針由于體積較大，無法單獨針對這些腦區(qū)。大尺寸的探針也會導致腦組織損傷，在這種損傷的情況下也可能導致測量結果與自發(fā)性癲癇的發(fā)作產生的結果相混淆［25］。最新的研究進展是使探針微型化。這意味著我們需要從中樞神經系統(tǒng)（CNS）的較小區(qū)域中獲得化學信息，而不影響中樞神經的神經化學恢復。這種小損傷并能獲取化學信息的方式可以通過推挽灌流取樣探針得到。這種微型化探針采用較低流量的流速采樣，使組織損傷最小，體外回收率相對較高［18］。微型化探針能夠測量活體小鼠大腦神經核團中的神經遞質變化，具有較高的空間分辨率［26］。此外，這種微型化探針比常規(guī)微透析探針產生的組織損傷更低［18］。這類探針在行為學研究中的效用在動物實驗里得到了證明，在利用微型化取樣探針在研究大鼠恐懼等行為發(fā)生時，可以記錄到大鼠海馬和基底外側杏仁核中細胞外鋅的水平升高［27］。因此，將微型化探針與高時間分辨率監(jiān)測技術相結合對神經化學物質的研究很有潛力［28］。

硅晶體推挽灌流探針的產生促使探針進一步小型化，更加適用于癲癇的研究［29］。這種微型化探針包含兩個20 微米的通道，其出入端是注射或收集液體（緩沖液/透析液）的端口，通過活體麻醉大鼠腦取樣，我們可以看到這種低流量推挽取樣探針的效用：該技術聯合液相色譜-質譜聯用（LC-MS）技術進行分析，硅晶體推挽灌流探針以50 nL/min 的速度在活鼠紋狀體取樣，通過液相色譜-質譜聯用（LC-MS）技術能夠從推挽灌流液中檢測出17 種神經遞質及其代謝產物［29］。硅晶體推挽灌流探針還可以將透析薄膜嵌入硅晶體探針其中，這樣就可以直接從這種類似大小的探針中進行微透析取樣［30］。這種微型化制造的微透析探針在對麻醉動物的苯丙胺給藥的動態(tài)體內化學變化的監(jiān)測上與傳統(tǒng)的微透析探針具有相同級別的表現，其在20 min 內檢測到的14 種神經化學物質與傳統(tǒng)微透析探針檢測到的結果一致，由于這種探針的橫截面積比傳統(tǒng)的微透析探針小79%，這使得它們可以用于小型的動物模型和較小的大腦區(qū)域［30］。因此我們可以利用這些微型探針對較小的大腦區(qū)域如下丘腦和腦核重聚體進行高空間分辨率的測量，通過微透析取樣來測量癲癇引起的神經化學變化，將會是研究癲癇的一種理想方法。

4 光遺傳學結合腦微透析技術

光遺傳學是另一種可以用于癲癇研究的技術。光遺傳學技術可以使用光來控制或監(jiān)測神經元活動，這些神經元已經被基因修飾可以表達光敏離子通道蛋白［31］，可以用于癲癇模型的研究。在癲癇模型的研究中，光遺傳學技術已成為抑制過度活躍神經元的重要工具，同時也可以刺激其他神經元可控地操縱癲癇發(fā)作［32］。無論是對興奮性主要細胞的光遺傳學抑制，還是對海馬神經元中GABA（γ-氨基丁酸）能細胞亞群的激活，都可以在光照下迅速阻止癲癇的發(fā)作［33］；此外，光遺傳學技術通過刺激谷氨酸能神經元亦能夠在存在完整的GABA 能傳遞的情況下觸發(fā)癲癇樣活動［34］。這可以為誘導和減輕癲癇發(fā)作提供一種可控的方法。

光遺傳學技術與腦微透析取樣結合神經化學監(jiān)測的一些挑戰(zhàn)包括神經化學技術的專業(yè)知識、能夠實現高采樣及分辨率的分析方法，并利用光遺傳學技術控制來確定激光或熱能對非靶向內源性離子通道或生物化學物質的影響［35］。這兩種技術的結合將會使人們能夠更徹底地了解潛在的神經回路及其對神經行為的影響，比如癲癇。聯合微透析的光遺傳學探針可以用于癲癇研究中光遺傳學神經元刺激期間的神經化學監(jiān)測，能夠測量受控癲癇發(fā)作期間、之前和之后的神經化學物質的變化［36］。這可以顯示出神經化學生物標志物與癲癇發(fā)作和復雜行為狀態(tài)的相關性，進而更好地對癲癇的發(fā)作進行研究［36］。然而，光遺傳學技術與微透析取樣相結合的研究范圍相當有限，因為目前它不能與電生理學和光刺激期間觀察到的行為變化相結合［35］。因此光遺傳學技術與微透析技術結合需要進一步的研究和改進。

5 展望

腦微透析技術對于癲癇的發(fā)作機制及預測的研究仍在不斷完善和更新，隨著更高時間分辨率技術的出現以及微型化探針的改進，將更好地對癲癇的發(fā)作進行預測。同時利用光遺傳學技術控制神經元的興奮性產生可控的癲癇模型，并與腦微透析技術相結合，可以用于研究神經化學生物標志物與癲癇發(fā)作和復雜行為狀態(tài)的相關性，從而進一步研究癲癇背后的機制，并為癲癇的治療做出更好地調整。

【Author contributions】YUAN Yu：Conceptualization，Writing-Revewing and Editing.LI Xiaojie：Writing-Original draft preparation.TAN Dong：Writing-Revewing and Editing.DU Yumin：Writing-Revewing and Editing.All authors read and aplproved the final manuscript.