吳俊檄 唐欲博 令狐熙濤 包廣龍 施浩然 文振宇 黃帥 瓦慶德

1遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨外科（貴州遵義563000）；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部（廣州510260）；3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科（廣州510260）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，且呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)于PCa 骨轉(zhuǎn)移患者，其生存質(zhì)量差且總體生存率欠佳［1-2］。隨著PCa 骨轉(zhuǎn)移機(jī)制探索的不斷深入，許多骨靶向藥物及新型治療藥物被陸續(xù)應(yīng)用于臨床，盡管其治療取得了部分進(jìn)展，但其效果仍有待進(jìn)一步提高［3-4］。因此，探索抑制PCa 骨轉(zhuǎn)移的新型治療藥物具有重要的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛（CA）是一種存在于肉桂和月桂葉中的天然化合物，具有較好的抗瘤活性，其可通過調(diào)控微小RNAs（microRNAs，miRNAs）及相關(guān)信號(hào)通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5-9］。近來研究發(fā)現(xiàn)，CA 對(duì)PCa 細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，其可通過自噬依賴性細(xì)胞凋亡的方式誘導(dǎo)PCa 細(xì)胞死亡［6］。然而，CA 能否通過調(diào)控miRNA 的表達(dá)影響PCa 骨轉(zhuǎn)移目前尚未明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-143 是PCa 骨轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子，在PCa 骨轉(zhuǎn)移性腫瘤中的miR-143 表達(dá)水平明顯低于原發(fā)性腫瘤，miR-143 可通過調(diào)控PCa 骨轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞（PC-3細(xì)胞）的EMT及干細(xì)胞特性抑制PCa 骨轉(zhuǎn)移［10-11］。因此本研究以PC-3細(xì)胞為研究對(duì)象，擬進(jìn)一步探索CA 能否通過調(diào)控miR-143 表達(dá)影響PC-3細(xì)胞的增殖、EMT及干細(xì)胞特性，為CA 作為潛在的抗PCa 骨轉(zhuǎn)移藥物提供前期實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料PC-3細(xì)胞（人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤來源細(xì)胞株）（ATCC 公司），純度≥95%的肉桂醛溶液（美國Sigma 公司），AGO2、ZEB1、N-cadherin、fibronectin、vimentin、CD44、Oct-4、c-Myc 及α-tubuin 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司），CCK-8試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA 抽提試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司），超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒及BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察調(diào)整PC-3細(xì)胞懸液的密度為1 × 104個(gè)/孔，接種至24 孔板中，然后分別加0、5、10、20 μmol/L 的CA 溶液共培養(yǎng)24 h，鏡下觀察PC-3細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.2 CCK-8 試驗(yàn)調(diào)整PC-3細(xì)胞懸液濃度后接種至96 孔培養(yǎng)板中（密度為4 × 103個(gè)/孔），細(xì)胞貼壁后加入0、5、10、15、30、60 μmol/L 的CA 溶液，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后在每個(gè)孔中加入CCK-8試劑液10 μL，孵育2 h 后檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.3 Transwell 試驗(yàn)將密度為1 × 106個(gè)/mL 的PC-3細(xì)胞懸液100 μL 接種于Transwell 上室，0、5、10、20 μmol/L 的CA 溶液加入下室然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，固定、洗滌，小心去除上室面的PC-3細(xì)胞，然后染色，晾干，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞特點(diǎn)，拍照并計(jì)算數(shù)量，算出平均值。在檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力時(shí)，不需要在上室中添加Matrigel 基質(zhì)膠，而在檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力時(shí)，需要將Matrigel 基質(zhì)膠稀釋液（1∶5）包被在Transwell上室中，其余條件同遷移試驗(yàn)。

1.2.4 黏附試驗(yàn)取部分PC-3細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/孔）接種到6孔板中，然后加入0、5、10、20 μmol/L 的CA 溶液處理24 h，重懸每組細(xì)胞至1 × 104個(gè)/孔后接種在FN 包被的96 孔板中，培養(yǎng)2 h 后，封閉，洗滌，固定，染色，然后在顯微鏡下觀察，拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 成球試驗(yàn)0、5、10、20 μmol/L 的CA 與PC-3細(xì)胞共同孵育24 h。0.25%胰酶消化PC-3細(xì)胞后用無血清RPMI1640 培養(yǎng)基制作細(xì)胞懸液至1 ×106個(gè)/mL，接種于24 孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，計(jì)數(shù)球體數(shù)量，觀察拍照。

1.2.6 qRT-PCR 分析0、5、10、20 μmol/L 的CA溶液分別與PC-3細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h，低溫環(huán)境下抽提總RNA，然后將總RNA 樣本立即逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用實(shí)時(shí)PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-143、AGO2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。相關(guān)引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequence of primers used for qRT-PCR

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.25%胰酶消化PC-3細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液，接種至6 孔平板中（1 × 106個(gè)/孔），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞密度至40%，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將miR-143mimic、AGO2-siRNA 或AGO2 mRNA 轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞。

1.2.8 Western blot 分析分別用10 μmol/L 的CA溶液、miR-143mimic、Vetor 轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，接種四組PC-3細(xì)胞24 h 后，混合裂解液提取總蛋白并進(jìn)行BCA 標(biāo)準(zhǔn)法定量。在10%～12%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)，2 h 后封閉，1 h 后加入一抗稀釋液AGO2、ZEB1、N-cadherin、fibronectin、vimentin、CD44、Oct-4、c-Myc 和α-tubuin，避光低溫孵育。然后加入二抗低速震蕩1 h，洗滌3 次，選用ECL 發(fā)光檢測(cè)，曝光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 18.0 及GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示資料的數(shù)據(jù)。通過t檢驗(yàn)、單因素方差分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA 對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、黏附及成球的影響CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CA 呈濃度依賴性抑制PC-3細(xì)胞的增殖（P＜0.01，圖1B），其IC50值約為19 μmol/L，選用0、5、10、20 μmol/L 濃度梯度的CA 溶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隨著CA 濃度不斷增加PC-3細(xì)胞的形態(tài)從規(guī)則梭形逐漸變成圓形并出現(xiàn)細(xì)胞碎片（圖1C）。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CA 可抑制PC-3細(xì)胞的體外遷移及侵襲能力，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1D-E）。黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CA 可降低PC-3細(xì)胞的黏附能力（P＜0.01，圖1F）。成球?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，加入CA 后PC-3細(xì)胞的成球能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖1G）。

圖1 CA 抑制PC-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、黏附及成球能力（× 100）Fig.1 CA inhibited proliferation，migration，invasion，adhesion and spheres formation of PC-3 cell in vitro（× 100）

2.2 過表達(dá)AGO2 可逆轉(zhuǎn)CA 及miR-143 對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲、遷移和黏附的影響

2.2.1 CA對(duì)PC-3細(xì)胞中miR-143及AGO2 mRNA表達(dá)的影響qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CA可顯著上調(diào)miR-143的表達(dá)（P＜0.01，圖2A）；同時(shí)，CA 可呈濃度依賴性下調(diào)PC-3細(xì)胞中AGO2 mRNA 的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2B）。

圖2 CA 上調(diào)PC-3細(xì)胞中miR-143 表達(dá)，抑制AGO2 mRNA 的表達(dá)Fig.2 CA upregulate the expression of miR-143 and downregulate the expression of AGO2 mRNA in PC-3 cells

2.2.2 CA、AGO2 及miR-143 對(duì)PC-3細(xì)胞遷移、侵襲和黏附的影響Transwell 及基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對(duì)照組比，CA、過表達(dá)miR-143 及沉默AGO2 均能抑制PC-3細(xì)胞的遷移、侵襲及黏附（P＜0.01），而同時(shí)加入CA 及上調(diào)AGO2、同時(shí)上調(diào)miR-143 及AGO2 后PC-3細(xì)胞遷移、侵襲及黏附的抑制作用較對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 AGO2 可逆轉(zhuǎn)CA 或過表達(dá)miR-143 對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲、遷移和黏附的抑制作用Fig.3 AGO2 rescued the effects of overexpressed miR-143 or CA on migration，invasion and adhesion of PC-3 cells in vitro

2.3 CA 及miR-143 對(duì)PC-3細(xì)胞EMT及干細(xì)胞特性的影響Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入CA 或上調(diào)miR-143 后PC-3細(xì)胞中AGO2 及EMT 相關(guān)蛋白波形蛋白、N-鈣黏蛋白、纖連蛋白及ZEB1 的表達(dá)明顯下降（P＜0.05，圖4A）；此外，CA 或上調(diào)miR-143后PC-3細(xì)胞的干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白CD44、Oct-4及c-Myc 蛋白的表達(dá)均明顯下降，與對(duì)照組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。

圖4 CA 或過表達(dá)miR-143 抑制PC-3細(xì)胞中AGO2、EMT及干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 CA or overexpression of miR-143 inhibits the expression of AGO2，EMT and stem cell property related proteins of PC-3 cells in vitro

3 討論

PCa 骨轉(zhuǎn)移的治療方式包括非骨特異性抗癌藥物治療、分子靶向藥物治療及放射性藥物治療等，雖提高了部分患者總體生存率，但總體療效仍欠佳［12-13］。隨著CA 抗腫瘤作用的不斷深入研究，MEI 等［14］提出CA 可通過調(diào)控TLR4 依賴的信號(hào)通路影響PCa 相關(guān)成纖維細(xì)胞的功能，進(jìn)而抑制PCa的進(jìn)展。此外，CA 還可通過抑制腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的線粒體功能或作為天然蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)PCa 細(xì)胞凋亡［7，15］。本研究發(fā)現(xiàn)，CA 可呈濃度依賴性抑制PC-3細(xì)胞的增殖，其24 h 的IC50值約為19 μmol/L。此外，Transwell、基質(zhì)黏附及成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示CA 可在體外抑制PC-3細(xì)胞的遷移、侵襲、黏附及成球能力。

PCa 的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展是受多種機(jī)制調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。miRNAs 可通過轉(zhuǎn)錄后抑制的方式發(fā)揮抗腫瘤作用，Argonaute2（AGO2）蛋白作為RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的核心成分，可與miRNAs 之間相互調(diào)控進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［16］。研究報(bào)道，CA 抑制腫瘤的惡性生物學(xué)行為與其可調(diào)控miRNA 的表達(dá)有關(guān)［8，17］。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-143 是PC-3細(xì)胞遷移侵襲的負(fù)向調(diào)控因子，且AGO2 可與miR-143結(jié)合［10，11，18］。本研究通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)CA 可上調(diào)PC-3細(xì)胞中miR-143 的表達(dá)，并抑制AGO2 mRNA的表達(dá)；此外，過表達(dá)miR-143 后PC-3細(xì)胞中AGO2表達(dá)明顯下調(diào)，提示miR-143 可調(diào)控AGO2 的表達(dá)。本研究進(jìn)一步探討CA 抗PC-3細(xì)胞活性的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA、過表達(dá)miR-143 及沉默AGO2 均能抑制PC-3細(xì)胞的遷移、侵襲及黏附能力；功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)提示，過表達(dá)AGO2 可逆轉(zhuǎn)CA 及miR-143 對(duì)PC-3細(xì)胞遷移、侵襲及黏附的抑制作用。上述結(jié)果說明，CA可能通過上調(diào)miR-143/Ago2軸抑制PC-3細(xì)胞的遷移、侵襲及黏附。

腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移及侵襲能力，此外，當(dāng)PCa 細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化時(shí)，腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力也會(huì)明顯增強(qiáng)［19］。因此，抑制干細(xì)胞特性及EMT 可成為抑制PCa 骨轉(zhuǎn)移潛在治療方式［20-21］。研究發(fā)現(xiàn)CA 可以通過逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌的EMT 過程來抑制腫瘤細(xì)胞黏附及生長［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，CA 可濃度依賴性抑制PC-3細(xì)胞的成球能力，并抑制PC-3細(xì)胞中EMT及干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白的表達(dá)，說明CA 對(duì)PC-3細(xì)胞的EMT及干細(xì)胞特性具有抑制作用。此外，上調(diào)miR-143 后PC-3細(xì)胞中N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖連蛋白、ZEB1 及CD44+、Oct-4、c-Myc 表達(dá)水平均明顯降低。綜合上述研究結(jié)果，本研究推測(cè)CA 可抑制PC-3細(xì)胞的EMT及干細(xì)胞特性，其機(jī)制可能與其能上調(diào)miR-143/AGO2 軸有關(guān)。

綜上所述，本研究表明CA 可在體外抑制PC-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及黏附能力；CA 還可抑制PC-3細(xì)胞的EMT及干細(xì)胞特性，其機(jī)制可能與其能上調(diào)miR-143/AGO2 軸有關(guān)。本研究主要探索了CA 在體外對(duì)PC-3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用，尚未探討miR-143/AGO2 軸在CA 抑制PCa 骨轉(zhuǎn)移生長與轉(zhuǎn)移中的詳細(xì)作用機(jī)制和體內(nèi)抑瘤效果，因此在下一步研究中將會(huì)重點(diǎn)對(duì)其展開研究，以期為CA 作為抗PCa 骨轉(zhuǎn)移的潛在治療藥物提供前期實(shí)驗(yàn)參考。

【Author contributions】Wu Junxi wrote the article.TANG Yubo，LINGHU Xitao and BAO Guanglong performed the experiments.SHI Haoran and WEN Zhenyu collected data.HUANG Shuai and WA Qingde designed the study.All authors read and aplproved the final manuscript as sub-mitted.