摘 要：為提高海藻生物活性物質(zhì)的利用率，增加飲料品種多樣性，對(duì)孔石莼（Ulva pertusa）多糖進(jìn)行提取并制備富含孔石莼多糖的飲料。采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助纖維素酶法提取孔石莼的多糖工藝，采用正交試驗(yàn)對(duì)孔石莼多糖飲料的口感進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：孔石莼多糖提取最優(yōu)工藝參數(shù)為酶添加量500 IU/g，料液比為1∶60，超聲功率500 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間40 min，此條件下多糖提取率為14.26%?？资欢嗵秋嬃献罴雅浞剑嚎资欢嗵翘砑恿?0%，檸檬酸添加量0.4%，白砂糖添加量9%。

關(guān)鍵詞：孔石莼；多糖；響應(yīng)面優(yōu)化；飲料；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S986.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

威海市位于山東半島東北部，三面瀕臨黃海，關(guān)于該地區(qū)海洋資源利用的研究主要集中在遠(yuǎn)洋漁業(yè)、海洋牧場(chǎng)、海洋休閑旅游、海洋生物與健康食品等領(lǐng)域；而對(duì)于該地區(qū)海洋資源的精深加工及功能性海洋食品開發(fā)的研究報(bào)道還較少。威海地區(qū)的藻類資源十分豐富，約有64種藻類。目前，該地區(qū)藻類資源主要用于人畜食用、有機(jī)肥料、魚類餌料、化工原料、供應(yīng)氧氣、凈化水質(zhì)等方面，對(duì)于藻類資源的深度開發(fā)研究較少。孔石莼（Ulva pertusa）是一種大型綠藻，屬綠藻門石莼科石莼屬[1]，在威海沿海地區(qū)分布較廣泛，是黃渤海地區(qū)產(chǎn)量非常豐富的野生海藻[2-3]?？资换瘜W(xué)組分復(fù)雜，主要有多糖、蛋白質(zhì)、脂類、維生素以及礦物元素等，其中含量較高的組分多糖具有抗菌、抗氧化、抗病毒、降血糖等作用。

海藻多糖提取的傳統(tǒng)方法主要有酸提、堿提、水提，傳統(tǒng)方法提取時(shí)間較長、提取率不高。近年來，一些新的提取方法不斷涌現(xiàn)，如微波法、凍融法、酶法、超聲法、高壓電脈沖法、超濾法，新的提取方法較傳統(tǒng)方法能較大提高多糖提取率[4-6]。超聲輔助提取是利用超聲空化作用加速原料活性成分溶解的方法，是水提取法的物理強(qiáng)化。此方法能顯著縮短提取時(shí)間，減少料液比，并且無需高溫。酶輔助提取是通過分解原料細(xì)胞壁，去除非活性纖維素、淀粉等雜質(zhì)，提高多糖得率的方法。酶的專一性強(qiáng)、催化效率高且反應(yīng)條件較為溫和。酶法提取的多糖較為穩(wěn)定，且提取過程能耗較低，污染少，無需專用設(shè)備。常用于多糖提取的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和淀粉酶等，最常用的是纖維素酶和果膠酶。將超聲波提取和酶輔助提取結(jié)合起來，能達(dá)到較好的提取效果[7]。張丹鶴等[8]采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化酶輔助法提取多糖工藝與正交優(yōu)化超聲波破碎工藝，得到超聲波輔助酶解法提取多糖的最佳提取條件，在最佳提取條件下馬尾藻多糖的提取率比采用單獨(dú)酶解法的提取率高3.41%。郎青云等[9]以甜葉菊為原料，采用超聲輔助纖維素酶法提取甜菊糖，得到最適提取條件，在最適條件下甜菊糖的提取率為18.86%。

本試驗(yàn)經(jīng)過前期方法探索，最終采用超聲波輔助纖維素酶法提取孔石莼多糖，同時(shí)采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并利用孔石莼多糖提取液開發(fā)制備一種多糖飲料，以期為孔石莼等海藻類資源的精深加工以及威海地區(qū)海洋資源的開發(fā)利用提供思路[10-13]。

1 材料與方法

1.1 原料

孔石莼，2021年10月采自威海海邊。

1.2 化學(xué)試劑

φ（乙醇）=95%，淄博鑫榮化工科技有限公司；苯酚，南京寧康化工有限公司；濃硫酸，杭州傲鷹化工有限公司；纖維素酶（1.8×105 IU/g），日本天野酶制品株式會(huì)社；白砂糖、檸檬酸，市售。

1..3 主要儀器設(shè)備

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，濟(jì)南童鑫生物科技有限公司；DZF-6020真空干燥箱，常州恩培儀器制造有限公司；FSD-100粉碎機(jī)，鄭州中谷機(jī)械設(shè)備有限公司；CRJ-0.03/60均質(zhì)機(jī)，廊坊市成瑞機(jī)械設(shè)備有限公司；L3-5K低速離心機(jī)，鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 多糖提取工藝優(yōu)化

1）多糖的提取方法。將孔石莼原料用自來水沖洗，再用蒸餾水清洗，晾干。將樣品烘干后粉碎，用φ（乙醇）=95%浸泡48 h后過濾。烘干得脫脂孔石莼，密封備用[14-15]。

取一定量的孔石莼粉末（60目篩），加入適量蒸餾水和纖維素酶，調(diào)節(jié)酶的最適pH，在一定超聲功率、超聲溫度下提取一定時(shí)間。隨后進(jìn)行沸水水浴15 min，鈍化酶活力。將提取完的溶液用200目絹布過濾，而后進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時(shí)間10 min，取上清液。將上清液進(jìn)行真空濃縮，冷藏6 h后加入φ（乙醇）=95%進(jìn)行醇沉，搖晃30 min，靜置12 h，以1 500 r/min離心6 min，取沉淀備用。之后加水溶解，真空濃縮，真空干燥48 h。將干燥的樣品研磨成粉末狀，置于培養(yǎng)皿中，置于4 ℃冰箱備用[16-17]。

2）孔石莼多糖提取率的測(cè)定。采用苯酚-硫酸法測(cè)定孔石莼多糖含量[18-19]。準(zhǔn)確配制1 L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，質(zhì)量濃度為100 mg/L。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水補(bǔ)足至1.0 mL，加0.5 mL苯酚、2.5 mL濃硫酸，反應(yīng)10 min后在490 nm下測(cè)定吸光度。以橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量x（μg），縱坐標(biāo)為吸光度y作標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

配制孔石莼多糖溶液，質(zhì)量濃度為100 mg/L。取0.5 mL孔石莼多糖，加水補(bǔ)足至1.0 mL。在490 nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算孔石莼多糖溶液含糖量，之后根據(jù)以下公示計(jì)算多糖提取率：多糖提取率=孔石莼多糖含量/孔石莼原料質(zhì)量×100%。

3）單因素試驗(yàn)。分別以料液比、酶添加量、提取時(shí)間、提取溫度考察各因素對(duì)孔石莼多糖提取率的影響。

4）響應(yīng)面試驗(yàn)。以料液比、酶添加量、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，利用響應(yīng)面軟件進(jìn)行分析。

1.4.2 孔石莼多糖飲料最佳配方確定

1）孔石莼多糖飲料制備工藝流程。孔石莼多糖提取液→混料→均質(zhì)（60 ℃、20 MPa）→過濾→灌裝封口→滅菌（95 ℃、20 min）→冷卻→成品。

2）孔石莼多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取以孔石莼多糖提取液、檸檬酸、白砂糖的添加量為自變量，飲料的感官評(píng)分為因變量，設(shè)計(jì)L9（33）的正交試驗(yàn)確定飲料產(chǎn)品的最佳配方。

3）產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)。選擇20名熟悉產(chǎn)品指標(biāo)的人員，經(jīng)過培訓(xùn)之后組成感官評(píng)價(jià)小組。感官評(píng)價(jià)小組依據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)打分。各評(píng)價(jià)員的評(píng)分為產(chǎn)品最終得分。產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

4）產(chǎn)品的理化及微生物指標(biāo)測(cè)定。酸度、可溶性固形物、總糖、菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)分別參照GB 5009.239—2016、GB/T 12143—2008、苯酚-硫酸法[18-19]、GB 4789.2—2016、GB 4789.3—2016介紹的方法測(cè)定。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 響應(yīng)面分析結(jié)果利用Design-Expert 8.0.6所提供的Box-Behnken模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)吸光度值測(cè)定結(jié)果，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為y = 0.019 6x+0.035 2，其相關(guān)系數(shù)為0.996，在葡萄糖質(zhì)量濃度為10～50 mg/L范圍內(nèi)，具有良好線性關(guān)系（圖1）。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響 在酶添加量為500 IU/g、提取時(shí)間為40 min、超聲溫度為50 ℃時(shí)，觀測(cè)料液比對(duì)多糖提取率的影響（圖2）。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨料液比逐漸增加，孔石莼多糖提取率先增加后緩慢降低。當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，多糖提取率最高，之后逐漸緩慢下降的原因可能是液料比更大時(shí)單位體積受到的超聲作用變小，從而影響提取率；也可能由于增加水的量會(huì)降低酶的濃度，從而影響可溶性多糖溶出；此外，料液比增加，在提取過程中損失率也可能會(huì)增加，導(dǎo)致多糖提取率降低。此結(jié)果與馮學(xué)珍等[1]提取廣西北部海灣的石莼多糖的結(jié)果相符。

2.2.2 酶添加量對(duì)多糖提取率的影響 當(dāng)料液比為1∶50、超聲溫度為50 ℃、提取時(shí)間為40 min時(shí)，觀測(cè)纖維素酶添加量對(duì)多糖提取率的影響（圖3）。結(jié)果顯示，當(dāng)酶添加量低于500 IU/g時(shí)，隨著酶添加量的增加，孔石莼多糖提取率不斷提高；當(dāng)酶添加量高于500 IU/g，繼續(xù)增加酶添加量，多糖提取率變化不明顯?？梢姡谶m宜的條件下，當(dāng)纖維素酶添加量較少時(shí)，底物與酶作用不充分，原料中的纖維素得不到充分降解，影響多糖溶出；當(dāng)酶添加量達(dá)到一定程度時(shí)，樣品中纖維素完全降解，可溶性多糖完全溶出，此時(shí)繼續(xù)添加酶，多糖提取率不再有顯著提高[21]。李燕妹等[22]采用超聲輔助酶法提取福建沿海地區(qū)的石莼中的功能性寡糖，研究纖維素酶使用量對(duì)寡糖提取率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著纖維素酶使用量的增加，提取率先提高后呈平穩(wěn)狀態(tài)，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 當(dāng)料液比為1∶50、酶添加量為500 IU/g、超聲溫度為50 ℃時(shí)，觀測(cè)提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響（圖4）。結(jié)果顯示，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，超聲時(shí)間延長時(shí)，孔石莼多糖提取率先增加后下降?？资欢嗵翘崛÷试诔晻r(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最高，再增加時(shí)間，多糖提取率下降。分析原因可能是隨著超生時(shí)間延長，多糖性質(zhì)發(fā)生改變或者降解。

2.2.4 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響 當(dāng)料液比為1∶50、酶添加量為500 IU/g、提取時(shí)間為40 min時(shí)，觀測(cè)超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響（圖5）。結(jié)果顯示，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高時(shí)，多糖提取率先增加后下降，多糖提取率在超聲溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到最高。分析原因，纖維素酶在一定的溫度范圍內(nèi)發(fā)揮作用，當(dāng)?shù)陀谧钸m溫度時(shí)，提高溫度有利于可溶性物質(zhì)溶解，當(dāng)超過最適溫度時(shí)，隨溫度升高酶活力降低。湯宇青等[23]研究超聲波輔助酶法脫除石莼水溶性膳食纖維中蛋白質(zhì)的工藝，發(fā)現(xiàn)超聲溫度在一定范圍內(nèi)對(duì)石莼水溶性膳食纖維脫蛋白的效果顯著，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)蛋白脫除率最高，當(dāng)溫度繼續(xù)升高蛋白脫除率降低，蛋白脫除率整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。蛋白脫除率越高表明多糖提取率越高，因此蛋白脫除率與多糖提取率呈正比，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 單因素試驗(yàn)顯示4個(gè)因素對(duì)孔石莼多糖提取率均有較明顯的影響。以4個(gè)因素為自變量，其中A、B、C、D分別代表料液比、酶添加量、超聲時(shí)間、超聲溫度，以多糖提取率為因變量（Y），設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表2）。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.3.2 回歸模型建立及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：多糖提取率=14.67+0.088A+0.14B+0.24C+0.029D+0.17AB+0.065AC-0.34AD+0.28BC+0.15BD+0.27CD-0.087A²-0.43B²-0.74C²-0.85D²。方差分析見表4。

由表4可知，模型F值為58.73，Plt;0.000 1，表明此模型差異極顯著，擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小[24]。失擬項(xiàng)：F=1.36，P=0.410 8gt;0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明方程對(duì)實(shí)際擬合誤差小，可采用其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行估算[25]。

由表5可知，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R²=0.983 3，調(diào)整確定系數(shù)R²_Adj=0.966 5，96.65%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用該模型進(jìn)行分析，可用于預(yù)測(cè)孔石莼多糖提取。離散系數(shù)CV值為0.79%，說明試驗(yàn)的穩(wěn)定性較高。信噪比為26.483，表明可信度較高。綜合考慮，回歸模型擬合度好，試驗(yàn)操作可信度高，能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)孔石莼多糖的提取，具備一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義[26]。各交互因素的響應(yīng)曲面見圖6。

一次項(xiàng)B、C極顯著，A顯著，D不顯著；交叉項(xiàng)AB、AD、BC、CD極顯著，BD顯著，AC不顯著；二次項(xiàng)B²、C²、D²極顯著，A²不顯著[27]；由F值可知，各因素對(duì)響應(yīng)值多糖提取率的影響大小依次為C、B、A、D，即超聲時(shí)間影響最大，其次是酶添加量、料液比，超聲溫度對(duì)孔石莼多糖提取率的影響不顯著。由圖6分析各個(gè)曲面投影圖可知，當(dāng)料液比為1∶40～1∶50，酶添加量為500～600 IU/g，超聲時(shí)間為40～50 min，超聲溫度為50～60 ℃，各曲面的多糖提取率較高，處于投影的中心位置。

2.3.3" 模型驗(yàn)證 根據(jù)回歸模型，通過軟件分析得出超聲輔助酶法提取孔石莼多糖的最佳工藝條件：料液比為1∶58.64，酶添加量為539.14 IU/g，超聲時(shí)間為42.17 min，超聲溫度為49.65 ℃，此時(shí)多糖提取率為14.78%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)條件，選取料液比為1∶60，酶添加量為500 IU/g，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為50 ℃，得到實(shí)際的多糖提取率為14.26%，這與理論預(yù)測(cè)值相差較小[28]。因此，響應(yīng)面可以用于超聲輔助酶法提取威海沿海地區(qū)的孔石莼中的多糖，這為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

2.4 孔石莼多糖飲料制備

2.4.1 孔石莼多糖飲料配方優(yōu)化 采用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝提取孔石莼多糖，而后制備多糖飲料。通過前期的單因素試驗(yàn)以及相關(guān)預(yù)試驗(yàn)，3個(gè)因素對(duì)多糖飲料口感有較明顯的影響。以3個(gè)因素為自變量，其中A、B、C分別代表孔石莼多糖溶液、檸檬酸、白砂糖的添加量，以飲料的感官評(píng)分為因變量（Y），設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)（表6）。試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見表7、表8。

由表7可知，3個(gè)因素對(duì)孔石莼多糖飲料感官品質(zhì)的影響大小依次是檸檬酸、白砂糖、孔石莼多糖提取液，得到孔石莼多糖飲料的最佳配方組合是A2B2C3，即孔石莼多糖提取液添加量50%，檸檬酸添加量0.4%，白砂糖添加量9%[29]。根據(jù)最優(yōu)組合方案，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出最終產(chǎn)品感官評(píng)分為88.24，表明通過該配方制備的孔石莼多糖飲料口感適宜。

2.4.2 產(chǎn)品的理化和微生物指標(biāo) 根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳配方參數(shù)制備孔石莼多糖飲料，對(duì)產(chǎn)品各項(xiàng)理化及微生物指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表9所示。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助纖維素酶法提取孔石莼多糖，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，得到了較好的效果。李燕妹等[22]采用超聲波輔助纖維素酶法提取石莼功能性寡糖，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝條件的優(yōu)化，得到石莼可溶性多糖的提取率為12.02%，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符，但其采用正交試驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化，這一點(diǎn)與本試驗(yàn)有所不同。任壯等[30]采用超聲波輔助復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）法并利用正交試驗(yàn)優(yōu)化海帶多糖提取和飲料配制工藝，制備了一款口感較好的海藻植物飲料。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化海藻多糖飲料工藝，建立了模型，能夠?yàn)槠渌惍a(chǎn)品工藝優(yōu)化提供參考。

試驗(yàn)得到的提取孔石莼多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)：料液比為1∶60，酶添加量為500 IU/g，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為50 ℃，實(shí)際提取率為14.26%。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化孔石莼多糖飲料配方，得到最優(yōu)配方：孔石莼多糖提取溶液添加量為50%，檸檬酸添加量為0.4%，白砂糖添加量為9%，此時(shí)產(chǎn)品感官得分為88.24。得出的產(chǎn)品口感獨(dú)特，酸甜適口。

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Response surface optimization of Ulva pertusa polysaccharide extraction and beverage preparation

Cong Yijie

（Department of Food and Medicine， Weihai Ocean Vocational College， Rongcheng 264300， China）

Abstract： In order to improve the utilization rate of seaweed bioactive substances and to increase the variety of beverages， Ulva perusa polysaccharide was extracted and beverage rich in ulva perusa polysaccharide was prepared. Response surface methodology （RSM） was used to optimize the ultrasound-assisted cellulase extraction process of ulva pertusa polysaccharide， and orthogonal experiment to optimize the taste of ulva perusa polysaccharide beverage. The results show that the optimal parameters for the extraction of Ulva pertusa polysaccharide are 500 IU/g of enzyme addition， 1∶60 material-to-liquid ratio， 500 W of ultrasonic power， 50 ℃ of ultrasonic temperature and 40 min of ultrasonic time， and the extraction rate is 14.26%. The best formula of ulva pertulva polysaccharide beverage is 50% of Ulva pertusa polysaccharide， 0.4% of citric acid and 9% of granulated sugar.

Key words： Ulva pertusa； polysaccharide； response surface optimization； drinks； orthogonal test

（責(zé)任編輯 魏 樂）